人脑胶质瘤组织中微小RNA-21与磷酸酶和张力蛋白同源基因的表达及其临床意义(2)
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1.2 实验试剂
Trizol购自美国Invitrogen公司；miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒及miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒购于北京天根生物技术有限公司；引物由上海生工生物技术有限公司合成；SP试剂盒、DAB试剂盒、苏木精染液及鼠抗人PTEN单克隆抗体均购自上海生工生物技术有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 组织总RNA提取用眼科剪将存于-80℃的组织剪碎，加入1 mL Trizol(将样品完全覆盖为宜)，按照Trizol说明书提取组织中总RNA。应用NANO-DROP 2000超微量分光光度计进行检测，选择OD260/280为1.8~2.0的RNA于-80℃保存备用。
1.3.2 RT-PCR检测胶质瘤组织中miR-21的表达量取总RNA 0.5 μg，应用miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒进行反转录，37℃反应60 min，-80℃备用。PCR扩增采用天根生物技术有限公司提供的miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒进行，上游引物根据试剂盒提供的设计方法进行设计，miR21的上游引物为：5'-GCGGTAGCTTATCAGACTGA-3'，内参U6的上游引物序列为：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物由试剂盒提供。PCR扩增条件为：94℃ 2 min，40个循环：94℃，20 s，60℃，35 s。每个反应设三个复孔，记录每个反应的CT值，实验结果采用2-ΔΔCT表示胶质瘤组织中miR-21相对于正常人脑组织的表达倍数(相对表达量)，其中△△CT=胶质瘤组织(CTmiR-21-CTU6)-正常脑组织(CTmiR-21-CTU6)。
1.3.3 SP法检测胶质瘤组织中PTEN的表达采用SP法进行PTEN检测，操作流程按照试剂盒说明书进行，用PBS作为阴性对照，已知PTEN阳性表达的胶质瘤标本作为阳性对照 ......
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