1.3 卵子冷冻解冻方法与实验分组

    冷冻：将3～4枚卵母细胞置于20 μL的ES液滴中，停留5 min，然后将卵子转移到另一个20 μL的VS液滴中，停留约40 s后立即装载至开放式冷冻载体上，并迅速置于液氮中，从开始暴露于VS到置于液氮中的时间不超过1 min。解冻：从液氮中取出装有卵子的冷冻载体，迅速置于37℃预热的WS1液中，停留1 min，随后将卵母细胞依次转移至室温平衡过的WS2、WS3、WS4中，各停留3 min后判断卵母细胞是否存活。随后将那些透明带和细胞膜完整、胞质透亮的存活卵母细胞置于含或不含Res的M2培养液中继续培养3 h，即依据是否在冷冻复苏培养液中添加Res分为对照组和Res组。Res在培养液中的浓度为25 μmol/L。

    1.4 ROS水平的检测

    二氯荧光素二乙酸(DCFH-DA)是检测ROS的常用试剂，本身没有荧光，但其可以自由穿过细胞并被细胞内的ROS氧化生成DCFH，而生成的DCFH能发出荧光却不能透过细胞膜，因此，DCFH逐渐在细胞内积累并能被激光共聚焦显微镜观察到。荧光强度越强，说明细胞内的ROS水平越高。检测时，将对照组和Res组的卵母细胞同时置于预热过的10 mmol/L的工作液中，避光并在37℃、5% CO2培养箱中孵育20 min ......