清润方对糖尿病大鼠肝脏SIRT/NF—κB信号通路的影响(3)
1.2.6 Western blot法检测各组肝组织中SIRT1、GLUT4及NF-κB蛋白表达水平 将提取的肝组织置于缓冲液(RIPA∶PMSF=500∶1)中,于玻璃匀浆器中制成匀浆,冰上孵育,超声处理,离心,提取组织蛋白。将样本定量于20 μL,凝胶电泳90 min,然后转膜90 min。转膜后,用5%的低脂蛋白封闭液封闭1 h,用5%BSA-TBST稀释鼠单克隆抗体SIRT1(1∶1000),4℃水平摇床孵育过夜。次日洗膜,TBST洗3次,每次10 min。用5%BSA-TBST稀释二抗山羊抗鼠IgG(H+L)HRP(1:10 000),室温孵育40 min。洗膜:TBST洗膜3次,每次10 min。ECL滴加到膜的蛋白面,反应3 min,胶片曝光。图片扫描后,使用软件Gel Image system ver. 4.00对图像进行灰度分析。采用β-actin作为内参对照,同样的方法测定NF-κB和GLUT4的蛋白水平。实验重复3次。1.3 统计学方法
用SPSS 18.0统计学软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验 ......
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