Akt抑制剂MK-2206对肝癌细胞huh7生物学行为的影响及机制(2)
1.2.4 Western blot测蛋白表达量差异 取对数生长期huh7细胞,接种于6孔板,待细胞贴壁24 h后,用不同药物浓度(0、2.5、5、10、20和40 μmol /L)处理24 h。加入 4℃预冷的细胞裂解缓冲液100 μL后,冰上作用30 min。用细胞刮刀刮取细胞碎片和裂解产物,移入1.5 mL离心管。用超声波细胞粉碎机粉碎上述产物后,4℃ 12 000 g/min高速冷冻离心20 min。BCA检测法检测蛋白浓度,用细胞裂解缓冲液调整各组间的蛋白浓度,使其一致,加入上样缓冲液,100℃加热5 min。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)凝胶电泳,将分离后蛋白电泳转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脱脂奶粉封闭1 h,洗膜3次后分别加入一抗(Akt、p-Akt、β-catenin及GAPDH)4℃摇床过夜孵育12 h,而后洗膜3次,加入二抗于摇床作用1 h,再次洗膜3次,于Odyssey上扫膜 ......
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