祛风解痉方调节γδT细胞抑制哮喘小鼠气道高反应性的分子机制(3)
1.2.5 CCK-8检测γδT细胞的增殖活性 取扩增10 d的小鼠肺组织γδT细胞，CCK-8检测分选纯化后γδT细胞的增殖活性。接种培养10 d的各组肺气道组织γδT细胞，向每孔加入10 μL CCK-8反应液，然而将培养板置于5% CO2、37℃恒温培养箱内孵育4 h。最后用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
1.2.6 Western blot检测不同信号通路分子的磷酸化水平 收集适量的γδT细胞用含有蛋白酶抑制剂(Complete，Roche)的裂解液进行裂解(50 mmol/L Tris-Cl pH 7.4，1 mmol/L EDTA pH 8.0，250 mmol/L NaCl，1% Triton-X)。蛋白裂解液浓度利用Bradford法进行测量(Bio-Rad No. 5000006)。10 μg细胞裂解液与5×样品缓冲液(15 g SDS， 15.6 mL 2 mol/L Tris pH 6.8，57.5 g glycerol，16.6 mL b-Mercaptoethanol)混合后，将样品上样至10%的聚丙烯酰胺凝胶中，SDS-PAGE分离并转移至PVDF膜上(Bio-Rad. NO. 162-0177)。用含0.1% Tween的4%牛奶进行封闭后，加入以下抗体，4 ℃孵育过夜：p-ERK1/2一抗稀释比1∶500。ERK1/2一抗稀释比1∶1000。p-P38一抗稀释比1∶500。P38一抗稀释比1∶500。β-catenin一抗稀释比1∶500。GAPDH一抗稀释比1∶1000。用含0.1% Tween的PBS溶液将膜洗3遍后，加入含0.1% Tween的4%牛奶以及HRP二抗(Dianova，Hamburg，Germany)在室温条件下孵育2 h。取出膜，在膜上滴加ECL显影液(Bio-Rad. NO. 170-5060)并放入GelDoc成像系统(Bio-Rad)进行拍照。蛋白表达水平用内参蛋白GAPDH进行归一化处理。
, 百拇医药
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0对所得数据进行统计学分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用ANOVA检验，组间比较采用LSD检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CCK-8检测γδT细胞的增殖活性
与空白对照组比较，哮喘模型组γδT细胞活性明显增强，差异有统计学意义(P < 0.05)。与哮喘模型组比较，祛风解痉方低剂量组的γδT细胞活性差异无统计学意义(P > 0.05)，而祛风解痉方中剂量组、祛风解痉方高剂量组以及醋酸泼尼松组的γδT细胞活性明显降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表1。
2.2 Western blot检测不同信号通路分子的磷酸化水平
, 百拇医药
与空白对照组比较，哮喘模型组p-ERK1/2、p-P38、β-catenin的蛋白表达量增加，差异有统计学意义(P < 0.05)，ERK1/2、P38蛋白表达水平差异无统计学意义(P > 0.05)。与哮喘模型组比较，祛风解痉方低、中、高剂量组以及醋酸泼尼松组的p-ERK1/2、p-P38、β-catenin的蛋白表达量减少，差异有统计学意义(P < 0.05)，而祛风解痉方中、高剂量组以及醋酸泼尼松组ERK1/2蛋白表达水平增加(P < 0.05)，祛风解痉方低剂量组以及醋酸泼尼松组P38蛋白表达水平增加，差异有统计学意义(P < 0.05)。见图1、表2。
3 讨论
哮喘的发病机制主要与气道炎症、气道高反应性、神经因素和变态反应等有关[9]。气道高反应性在哮喘诊断、病情评估及预后评价中具有重有意义[10]。哮喘发病迅速，时发时止，反复发作，发时痰鸣气喘，与风邪善行数变的性质相符，本课题组提出“风盛痰阻，气道挛急”是哮喘發作的主要病机之一，并特别指出此风不仅指外风侵袭可致哮病，而且内生肝风，夹瘀犯肺，风摇金鸣，亦可致哮喘即发[11]。“风盛痰阻，气道挛急”既是哮喘发作的病因，又是哮喘发病之结果，“风盛痰阻，气道挛急”的状态贯穿于哮喘的发作期、缓解期、稳定期整个病程中，这与哮喘重要特征气道高反应性存在高度一致。祛风解痉方药依据哮喘气道高反应性的关键病因病机“风盛痰阻，气道挛急”而组成，在临床观察中取得较好的疗效[11]。
, http://www.100md.com
细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)是90年代初期分离鉴定的一种蛋白激酶[12]。ERK是MAPKs家族一个重要亚族(ERK又称为MAPK)，ERK1和ERK2统称为ERK1/2，是其中的两个重要成员。MAPK信号转导通路是细胞内重要的信号转导系统，MAPK的组成是一种保守的三级激酶模式，包括MAPK激酶激酶、MAPK激酶、MAPK[13]，这3种激酶能依次激活，共同调节细胞的生长、分化、迁移、侵袭、凋亡、应激和炎性反应等重要的细胞生理和病理过程[14]。p38促分裂原活化的蛋白激酶(p38 MAPK)在激素抵抗型哮喘的发病过程中起着重要作用[15]。p38通路被促炎因子、细菌病原体及其代谢产物磷酸化激活，激活后的p38 MAPK由胞质进入细胞核内，活化转录因子，调节特定的基因表达参与应激条件下细胞的免疫炎性反应及细胞生长、细胞分化、细胞周期和细胞调死过程[16-17]。β-连环蛋白(β-catenin)最早作为一种黏附因子被发现，主要位于细胞膜，而在胞浆中游离量较少[18]。β-catenin是钙黏蛋白复合体的亚基，并且在Wnt信号途径中起细胞内信号转导的作用[19-20]。T细胞较其他免疫细胞表达更高水平的Wnt分子，预示这一通路在T细胞的应答过程中扮演着更为重要的角色[21]。
本研究结果显示，与空白对照组比较，哮喘模型组γδT细胞的细胞活性显著增强，提示哮喘模型鼠肺组织的炎性反应加重。祛风解痉方中剂量组、祛风解痉方高剂量组及醋酸泼尼松组的γδT细胞的细胞活性显著减弱，提示中药治疗和阳性药物治疗可以显著缓解哮喘模型小鼠肺组织的炎性反应，具有一定的治疗效果。同时本研究也深入研究了该反应途径的信号通路的具体分子机制，其中祛风解痉方药干预后的细胞p-ERK1/2、p-P38、β-catenin的蛋白表达量降低，提示哮喘模型小鼠γδT细胞中的MAPK及Wnt信号通路被激活，通过中药治疗或阳性药物治疗后，MAPK及Wnt信号通路一定程度上被抑制。, 百拇医药(樊长征 苗青 洪巧瑜)
1.2.6 Western blot检测不同信号通路分子的磷酸化水平 收集适量的γδT细胞用含有蛋白酶抑制剂(Complete，Roche)的裂解液进行裂解(50 mmol/L Tris-Cl pH 7.4，1 mmol/L EDTA pH 8.0，250 mmol/L NaCl，1% Triton-X)。蛋白裂解液浓度利用Bradford法进行测量(Bio-Rad No. 5000006)。10 μg细胞裂解液与5×样品缓冲液(15 g SDS， 15.6 mL 2 mol/L Tris pH 6.8，57.5 g glycerol，16.6 mL b-Mercaptoethanol)混合后，将样品上样至10%的聚丙烯酰胺凝胶中，SDS-PAGE分离并转移至PVDF膜上(Bio-Rad. NO. 162-0177)。用含0.1% Tween的4%牛奶进行封闭后，加入以下抗体，4 ℃孵育过夜：p-ERK1/2一抗稀释比1∶500。ERK1/2一抗稀释比1∶1000。p-P38一抗稀释比1∶500。P38一抗稀释比1∶500。β-catenin一抗稀释比1∶500。GAPDH一抗稀释比1∶1000。用含0.1% Tween的PBS溶液将膜洗3遍后，加入含0.1% Tween的4%牛奶以及HRP二抗(Dianova，Hamburg，Germany)在室温条件下孵育2 h。取出膜，在膜上滴加ECL显影液(Bio-Rad. NO. 170-5060)并放入GelDoc成像系统(Bio-Rad)进行拍照。蛋白表达水平用内参蛋白GAPDH进行归一化处理。
, 百拇医药
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0对所得数据进行统计学分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用ANOVA检验，组间比较采用LSD检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CCK-8检测γδT细胞的增殖活性
与空白对照组比较，哮喘模型组γδT细胞活性明显增强，差异有统计学意义(P < 0.05)。与哮喘模型组比较，祛风解痉方低剂量组的γδT细胞活性差异无统计学意义(P > 0.05)，而祛风解痉方中剂量组、祛风解痉方高剂量组以及醋酸泼尼松组的γδT细胞活性明显降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表1。
2.2 Western blot检测不同信号通路分子的磷酸化水平
, 百拇医药
与空白对照组比较，哮喘模型组p-ERK1/2、p-P38、β-catenin的蛋白表达量增加，差异有统计学意义(P < 0.05)，ERK1/2、P38蛋白表达水平差异无统计学意义(P > 0.05)。与哮喘模型组比较，祛风解痉方低、中、高剂量组以及醋酸泼尼松组的p-ERK1/2、p-P38、β-catenin的蛋白表达量减少，差异有统计学意义(P < 0.05)，而祛风解痉方中、高剂量组以及醋酸泼尼松组ERK1/2蛋白表达水平增加(P < 0.05)，祛风解痉方低剂量组以及醋酸泼尼松组P38蛋白表达水平增加，差异有统计学意义(P < 0.05)。见图1、表2。
3 讨论
哮喘的发病机制主要与气道炎症、气道高反应性、神经因素和变态反应等有关[9]。气道高反应性在哮喘诊断、病情评估及预后评价中具有重有意义[10]。哮喘发病迅速，时发时止，反复发作，发时痰鸣气喘，与风邪善行数变的性质相符，本课题组提出“风盛痰阻，气道挛急”是哮喘發作的主要病机之一，并特别指出此风不仅指外风侵袭可致哮病，而且内生肝风，夹瘀犯肺，风摇金鸣，亦可致哮喘即发[11]。“风盛痰阻，气道挛急”既是哮喘发作的病因，又是哮喘发病之结果，“风盛痰阻，气道挛急”的状态贯穿于哮喘的发作期、缓解期、稳定期整个病程中，这与哮喘重要特征气道高反应性存在高度一致。祛风解痉方药依据哮喘气道高反应性的关键病因病机“风盛痰阻，气道挛急”而组成，在临床观察中取得较好的疗效[11]。
, http://www.100md.com
细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)是90年代初期分离鉴定的一种蛋白激酶[12]。ERK是MAPKs家族一个重要亚族(ERK又称为MAPK)，ERK1和ERK2统称为ERK1/2，是其中的两个重要成员。MAPK信号转导通路是细胞内重要的信号转导系统，MAPK的组成是一种保守的三级激酶模式，包括MAPK激酶激酶、MAPK激酶、MAPK[13]，这3种激酶能依次激活，共同调节细胞的生长、分化、迁移、侵袭、凋亡、应激和炎性反应等重要的细胞生理和病理过程[14]。p38促分裂原活化的蛋白激酶(p38 MAPK)在激素抵抗型哮喘的发病过程中起着重要作用[15]。p38通路被促炎因子、细菌病原体及其代谢产物磷酸化激活，激活后的p38 MAPK由胞质进入细胞核内，活化转录因子，调节特定的基因表达参与应激条件下细胞的免疫炎性反应及细胞生长、细胞分化、细胞周期和细胞调死过程[16-17]。β-连环蛋白(β-catenin)最早作为一种黏附因子被发现，主要位于细胞膜，而在胞浆中游离量较少[18]。β-catenin是钙黏蛋白复合体的亚基，并且在Wnt信号途径中起细胞内信号转导的作用[19-20]。T细胞较其他免疫细胞表达更高水平的Wnt分子，预示这一通路在T细胞的应答过程中扮演着更为重要的角色[21]。
本研究结果显示，与空白对照组比较，哮喘模型组γδT细胞的细胞活性显著增强，提示哮喘模型鼠肺组织的炎性反应加重。祛风解痉方中剂量组、祛风解痉方高剂量组及醋酸泼尼松组的γδT细胞的细胞活性显著减弱，提示中药治疗和阳性药物治疗可以显著缓解哮喘模型小鼠肺组织的炎性反应，具有一定的治疗效果。同时本研究也深入研究了该反应途径的信号通路的具体分子机制，其中祛风解痉方药干预后的细胞p-ERK1/2、p-P38、β-catenin的蛋白表达量降低，提示哮喘模型小鼠γδT细胞中的MAPK及Wnt信号通路被激活，通过中药治疗或阳性药物治疗后，MAPK及Wnt信号通路一定程度上被抑制。, 百拇医药(樊长征 苗青 洪巧瑜)