1.5 Western blot分析

    每组取6只大鼠分离海马并提取蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白与上样缓冲液混合，100℃煮沸5 min，样品经电泳后电转至PVDF膜上，膜经BSA 37℃封闭1 h后与相应一抗[大鼠抗tPA抗体(Abcam，ab157469)、大鼠抗DNMT1抗体(Abcam，ab188453)及大鼠抗GAPDH抗体(上海碧云天生物技术研究所，AF0006)]结合，4℃孵育过夜。冲洗后滴加辣根过氧化酶标记的二抗37℃温孵2 h，漂洗后采用ECL法显色，以目的蛋白与GAPDH条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达水平。

    1.6 MeDIP-定量聚合酶链反应

    各组采用Qiagen基因组DNA提取试剂盒提取6只大鼠海马DNA并检测其纯度及完整性;采用超声仪对DNA进行随机片段化(400～500 bp)，并取5 μL于2%琼脂糖凝胶电泳;加热变性后将单链DNA样品分成两份，其中一份作为IP加入抗5-mC抗体，另一份作为input抗体。使用免疫磁珠分离上述样品中甲基化DNA片段的抗体复合物，通过酚氯仿抽提和乙醇沉淀法纯化免疫共沉淀的甲基化DNA片段(MeDIP)并检测DNA浓度。qPCR在荧光定量PCR 仪(ABI，StepOnePlus)上进行，分别记录Ct值，用Ctinput和CtMeDIP表示 ......