中药毒性的代谢组学研究(Ⅰ)：雷公藤甲素的肾脏毒性
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摘 要:目的：利用基于核磁共振的代谢组学方法探讨雷公藤甲素的肾脏毒性。方法: 以生物核磁共振结合模式识别技术和主成分分析法探讨雷公藤甲素口服给药对大鼠尿液内源性代谢产物的影响。结果：给药后，尿样中甘氨酸、醋酸盐、甜菜碱以及丙酮水平显著上升，分别显示首先是肾脏皮层S1受损伤，然后肾乳头受损伤，最后肾脏皮层S3段受到损伤。主成分分析表明，给药组与对照组的代谢谱有明显差异。结论：大鼠尿液的代谢物谱与雷公藤甲素对肾脏造成损害作用密切相关。利用代谢组学方法可以迅速、简便地分析雷公藤甲素肾脏毒性。
关键词：生物核磁共振;毒性;雷公藤甲素;代谢组学;主成分分析
中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-2197(2007)07-041-05
近年来,世界生物医学研究的热点之一是从全局观点分析生物体在生理、病理、药理及毒理状态下发生的各种动态变化，并形成了以基因组学、蛋白质组学及代谢组学为代表的现代组学分析技术[1-4]。代谢组 (Metabonome) 是反应机体状况的分子集合，所有对机体健康产生影响的因素均可反映在代谢组中，如基因、环境、营养、药物(外源物)和时间(年龄)最终通过代谢组对表达施加影响[5]。代谢组学(Metabonomics) 作为一门新兴的技术，其研究以生物体液(如血液、尿等)、细胞组织提取物、细胞培养液等为对象，通过定性定量地分析生物系统中内源性代谢物的变化来评价外源性刺激物(如药物、毒物)对机体带来的影响，即测定代谢组受外界刺激而发生的变化情况，同时对代谢组数据进行生物信息学分析，从系统生化谱的角度整体地研究生物体对外界刺激的调节及应答机制[6]。因此，通过分析内源性代谢物的变化，就能了解刺激物对机体的影响(无论是直接的还是间接的)。在动物实验中，采集上述生物样品，用代谢组学方法分析，就可以明了刺激物是否对机体发生作用和具体作用位置[7]。尤其对于药物的毒性所在受毒器官、程度以及可恢复性等方面都可得到检测。而且代谢组学方法可以监测尚未引起组织病理学变化的毒性，其优点十分明显。
雷公藤甲素 (triptolide) 是从卫矛科植物雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook. f) 中分离得到的活性最高的环氧化二萜内酯化合物，是雷公藤的主要有效成分之一，具有抗炎、免疫抑制、抗生育、抗肿瘤等生物活性，在临床上用于治疗器官移植的排斥反应、自身免疫性疾病、肾病综合征、癌症等，同时还可用于风湿性关节炎、类风湿性关节炎、跌打损伤、肾小球肾炎、红斑狼疮、肾病综合征等疑难病证的治疗[8]。文献报道雷公藤甲素的急性毒性以急性肝坏死为主[9]，亚慢性中毒者的主要死亡原因之一应为肾损害[10]。
本实验通过高分辨核磁共振技术，结合模式识别 (pattern recognition，PR) 以及主成分分析方法 (principal component analysis，PCA)，研究中药有效成分雷公藤甲素口服给药后对大鼠尿液中内源性代谢产物的影响，观察雷公藤甲素所致大鼠肾损伤及其过程，探讨代谢组学对中药毒性预测、分析方面的应用前景。
1 仪器及试验材料
仪器: Bruker DPX-300 核磁共振仪。
动物: 雄性SD大鼠 (约150g，购自南京中医药大学动物实验中心)。
实验试剂: 氘水，2,2,3,3-四氘代丙酸(TSP)购自Sigma公司。雷公藤甲素购自湖北黄石市制药厂生产黄石制药厂(每片含雷公藤甲素33 μg)，经提取精制后使用。
2 实验方法与结果
2.1 动物实验
SD大鼠10只，随机分为2组，将雷公藤甲素溶于食用色拉油中，每天早晨8点灌胃给药 (0.4 mg•kg-1•d-1)，连续给药七天，对照组给予色拉油。用代谢集尿装置收集七天的尿液。尿液离心(3000 rpm)，取上清液-20℃保存至测定。
2.2 核磁样品准备及分析
称取600 μL尿样，加入300 μL 1.0M磷酸缓冲液 (pH=7.0) 以消除pH变化导致的各谱图之间的差异，加入150 μL D2O用作锁场，D2O内含TSP 作为化学位移内标(δ = 0)。样品液3000 rpm离心10分钟，取上层清液，移入NMR样品管。样品测试在Bruker DPX-300核磁共振仪上进行，使用修改了的脉冲序列(zgpr)：水峰饱和 (pl9 ＝ 60 dB, d1 = 2s)，脉冲间隔为15.0 s。每个样品空扫4次，采样32次。所有实验都在5 mm的探头中进行，测试温度维持在300 K。
2.3 1H-NMR数据处理
使用AMIX (Bruker, version 3.6.8)将大鼠尿液1H-NMR图谱从δ0.0-10.0 ppm的范围按0.04ppm分段积分，除去水峰以及尿素峰所在化学位移 (δ= 4.2-6.0 ppm) 将谱图余下部分导出为积分数据。由于谱图6.0 ppm以上区域变化较小，而且在0.2-4.2 ppm可见相关信号，0.0-0.2 ppm仅包含TSP峰，因而选取0.2-4.2 ppm的谱图进行处理分析。
2.4 正常大鼠尿液1H-NMR谱图代谢物分析
图1(A)表示正常大鼠尿液的1H-NMR谱图和尿液中主要代谢物种的化学位移归属[1-4]。为了简化氢谱，同时消除诸如溶剂峰、基线噪音等影响，对所有氢谱利用Amix软件进行了处理[11]。如图1(B)所示，将氢谱按照0.04 ppm宽度进行积分，得到柱状图，用于进一步统计处理。
2.5 大鼠尿液 1H-NMR 谱图代谢物分析
图2显示了大鼠灌口服给药7天尿液的典型氢谱。从大鼠0.4 mg•kg-1•d-1剂量染毒后7天尿液的 NMR 谱图可以清晰的看出，甘氨酸 (glycine)、醋酸盐 (acetate)、甜菜碱 (betaine) 和丙酮 (acetone) 含量的升高为雷公藤谱图变化的主要部分。灌胃后1天即发现其甘氨酸、醋酸盐含量上升。甘氨酸、醋酸盐含量上升是肾脏皮层S1受损伤的标志之一，且与剂量呈正相关[12]，因此雷公藤甲素对肾的毒性首先是在皮层S1部分。甜菜碱在大约第3天时可观察到，且其含量在第6天几乎达到和TMAO同样多，由于甜菜碱是近曲小管重吸收的肾脏渗透压平衡化合物，因而其升高显示药物对肾乳头造成了损伤[13]。最后一天样品中出现了丙酮含量的大幅度增高，表明肾皮层S3段受到损伤[14]。以上数据可以清楚地表明雷公藤甲素对肾脏的毒性、毒性作用部位和过程 ......
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