采用GatewayTM技术构建人骨形态发生蛋白-2基因重组腺病毒载体

http://www.100md.com 2008年1月15日 蒋红梅　龙　洁　汤　炜　田卫东　刘　磊　林云锋　王　杭　李　

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     摘要目的：采用基于attLXattR 的姿噬菌体位点特异性重组系统的GatewayTM技术构建人骨形态发生蛋白-2 基因重组腺病毒载体(Ad-hBMP-2)。方法：从pcDNA3.1 质粒中获取目的基因hBMP-2 片段，连入带attL1、attL2 位点的入门载体pENTRTM11 中，形成入门克隆，将入门克隆与带attR1、attR2 位点的目的载体Ad/CMV/V5-DEST 在高效重组酶作用下发生体外重组形成表达克隆ad-BMP-2，经鉴定将ad-BMP-2 线性化后转入293A细胞包装，通过细胞裂解法获得人骨形态发生蛋白-2 的基因重组腺病毒珠Ad-hBMP-2，将其扩增，采用western blotting 技术分析目的蛋白表达。结果：经酶切及测序证实目的基因BMP-2 片段按正确方向重组入目的载体中，带BMP-2 的目的载体在293A 细胞中包装成功，获得成熟的病毒颗粒，测得病毒滴度为2.5× 10⁹pfu/ml，western blotting结果证实Ad-hBMP-2 在293A细胞中高效表达hBMP-2 蛋白。结论：本实验首次利用基于姿噬菌体的位点特异性重组系统的Gateway^TM技术成功构建了Ad-hBMP-2，该技术与传统构建方法比较具有高效性和灵活性，为进一步研究BMP-2 的生理功能和利用BMP-2 进行骨基因治疗奠定了实验基础。

    关键词：骨形态发生蛋白-2；Gateway^TM技术；重组腺病毒

    中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1673-6273(2008)02-0209-04

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