重组人PCNA突变体的克隆与稳定表达
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位全芳 杨劲 曾益军 周虎传 李劲 刘洋 李杰 第三军医大学基础部生化与分子生物学教研室 第三军医大学基础部生化与分子生物学教研室 第三军医大学基础部生化与分子生物学教研室 第三军医大学基础部生化与分子生物学教研室 第三军医大学西南医院全军泌尿外科研究所 第三军医大学西南医院全军泌尿外科研究所 第三军医大学西南医院全军泌尿外科研究所
【摘要】目的:构建重组人PCNA突变体(mutant PCNA,mPCNA)的真核表达质粒,并建立稳定高表达该目的蛋白的宫颈癌细胞系Hela,为进一步研究PCNA在DNA损伤修复中重要的生物学功能奠定基础。方法:将含有定点突变的PCNA cDNA序列克隆到T栽体中,然后再亚克隆到真核表达栽体pCDNA3.1/V5-His A上,构建真核表达载体质粒pCDNA3.1/V5-His A-mPCNA,稳定转染到Hela细胞中;Western B1otting法检测蛋白的表达情况;白细胞记数法测定细胞的生长速率。结果:真核表达质粒pCDNA3.1/V5-His A-mPCNA经酶切、测序分析与实验设计的序列完全一致;稳定建系后,Western Blotting结果显示在相应位置可见清楚的目的条带;稳定高表达mPCNA的细胞系与野生型细胞相比两者的生长速率基本一致。结论:成功构建了真核表达质粒pCD- NA3.1/V5-His A-mPCNA;建立了稳定高表达该突变体的Hela细胞系;PCNA突变体的高表达不影响Hela细胞的正常生长。
【关键词】 增殖细胞核抗原 突变体 稳定转染 Hela细胞
【分类号】Q78
增殖细胞核抗原(pro一i介rating eell nuelear anti罗n，pCNA)是一种表达水平随着细胞周期波动的高度保守的生长调控蛋白，可围绕DNA链组装成三聚体滑动夹，是DNA聚合酶pofs和pol。的辅助因子111。滑动夹PCNA能够以一定的秩序与多种蛋白如PZ一、即C(复制因子C)、Gadd45(growth
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摘要目的：构建重组人PCNA突变体(mutant PCNA, mPCNA)的真核表达质粒，并建立稳定高表达该目的蛋白的宫颈癌细胞系Hela，为进一步研究PCNA 在DNA 损伤修复中重要的生物学功能奠定基础。方法：将含有定点突变的PCNA cDNA序列克隆到T载体中，然后再亚克隆到真核表达载体pCDNA3.1/V5-His A上，构建真核表达载体质粒pCDNA3.1/V5-His A-mPCNA，稳定转染到Hela 细胞中；Western Blotting 法检测蛋白的表达情况；白细胞记数法测定细胞的生长速率。结果：真核表达质粒pCDNA3.1/V5-His A-mPCNA经酶切、测序分析与实验设计的序列完全一致；稳定建系后，Western Blotting 结果显示在相应位置可见清楚的目的条带；稳定高表达mPCNA 的细胞系与野生型细胞相比两者的生长速率基本一致。结论：成功构建了真核表达质粒pCDNA3.1/V5-His A-mPCNA；建立了稳定高表达该突变体的Hela 细胞系；PCNA突变体的高表达不影响Hela 细胞的正常生长。
关键词：增殖细胞核抗原；突变体；稳定转染；Hela 细胞
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