腺病毒介导的Her2基因RNAi载体的构建和鉴定
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高洋 杨红 闫岩 刘艳丽 张芳琳 吴兴安 辛晓燕 第四军医大学西京医院妇产科;第四军医大学基础医学部微生物学教研室;
【摘要】目的:构建腺病毒介导的Her2基因RNAi载体。方法:构建含有Her2基因片断的siRNA质粒Her2-pSuppressor,通过特异性酶切将目的基因与穿梭载体pshuttle相连,再通过特异性酶切位点将目的片断与腺病毒DNA相连,并用PCR和酶切鉴定方法进行筛选和鉴定,获得重组腺病毒DNA。以PacⅠ酶切线性化后转染包装含有腺病毒E1的HEK293细胞。以软琼脂平板上的空斑数量计算重组腺病毒的的滴度.结果:XbaⅠ+MluⅠ双酶切鉴定Her2a-RNAi/pShuttle和Her2b-RNAi/pshuttle阳性重组子获得304bp的目的片段,重组腺病毒载体Adeno-Her2a-RNAi和Adeno-Her2b-RNAi经PCR扩增出同样大小片断,经线性化后用脂质体法转染293细胞,观察到细胞病变效应。病毒滴度达1.2×10~8PFu/mL。结论:成功构建了Adeno-Her2-RNAi,为肿瘤的基因治疗奠定了良好的基础。
【关键词】 Her RNA干扰 基因 腺病毒 重组
【基金】国家自然科学基金(30772305)
【分类号】R346
剧吕人表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor re- eeptorZ，HER一2/neu，ethB一2)，也称pl85，属于人表皮生长因子受体酪氨酸激酶，由HerZ(ErbB一2)原癌基因编码。在许多上皮来源的恶性肿瘤(例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌)中HcrZ表达过高，患者预后很差，如降低其表
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摘要目的：构建腺病毒介导的Her2 基因RNAi 载体。方法：构建含有Her2 基因片断的siRNA 质粒Her2- pSuppressor，通过特异性酶切将目的基因与穿梭载体pshuttle相连，再通过特异性酶切位点将目的片断与腺病毒DNA 相连，并用PCR 和酶切鉴定方法进行筛选和鉴定，获得重组腺病毒DNA。以PacⅠ酶切线性化后转染包装含有腺病毒E1 的HEK293 细胞。以软琼脂平板上的空斑数量计算重组腺病毒的的滴度。结果：XbaⅠ+ MluⅠ双酶切鉴定Her2a-RNAi/pShuttle 和Her2b-RNAi/pShuttle 阳性重组子获得304bp 的目的片段，重组腺病毒载体Adeno-Her2a-RNAi和Adeno-Her2b-RNAi 经PCR扩增出同样大小片断，经线性化后用脂质体法转染293 细胞，观察到细胞病变效应。病毒滴度达1.2× 108 PFU/mL。结论：成功构建了Adeno-Her2-RNAi，为肿瘤的基因治疗奠定了良好的基础。
关键词：Her2；RNA 干扰；基因；腺病毒；重组
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