应用Ad Easy载体系统构建人B2-AR基因重组腺病毒

http://www.100md.com 2009年2月15日 宫海滨 魏 翠 张清林 吕 茜

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     摘要 目的：利用Ad easy腺病毒表达系统构建含人B₂肾上腺素能受体(B₂-ARAR)基因重组腺病毒，并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒。方法：将B₂-AR全长cDNA插入到腺病毒穿梭载体pAdTiaek-CMV，构建pAdTrackCMV-B₂-AR重组质粒，经Pme Ⅰ酶切线性化后经电击法转入含Ad easy质粒的电感受态菌BJ5183进行重组。挑选同源重组质粒，Pae Ⅰ酶切线性化转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒。将重组病毒和SD大鼠心肌细胞共培养，western-blot检测B₂-AR的表达。结果：琼脂糖凝胶电泳显示在1242bp处有特异性条带后被克隆至腺病毒穿梭质粒。重组穿梭载体经HindⅢ和XbaⅠ限制性酶切可以得到目的条带并经测序证实。电击法转化BJ5183所得候选重组子经PacⅠ酶切后得到30Kb腺病毒基因组片段和4.5Kb氨苄抗性片段，证实获得同源重组质粒。转染293细胞可以看到绿色荧光蛋白，以MOI100转染SD大鼠心肌细胞发现携带B₂-AR的腺病毒可以在心肌细胞中过表达。结论：利用新型腺病毒载体在短时间内成功掏建了携带有人B₂-AR基因的腺病毒，为进一步研究人B₂-AR基因治疗奠定了基础。

    关键词：Ad Easy腺病毒；人B₂肾上腺素能受体；大鼠；心肌细胞

    中图分类号：Q784 文献标识码：A 文章编号：1673-6273(2009)04-618-04

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