小鼠XBP1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及筛选
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钟河江 蒋建新 王海燕 杨策 张冲 严军 刘庆 黄苏娜 第三军医大学大坪医院野战外科研究所第四研究室全军交通医学研究所 全军交通伤重点实验室 创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室;
【摘要】目的:构建小鼠XBP1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体,筛选具有较好干扰效率的小鼠XBP1 siRNA靶序列。方法:针对小鼠XBP1基因特异性序列,设计4个RNAi靶序列及1个阴性对照序列,合成含有正义和反义OligoDNA的互补DNA序列,退火形成双链DNA,并克隆到经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,DNA测序鉴定。由病毒包装系统进行包装,经滴度测定后感染NIH3T3细胞,应用Real-timePCR鉴定干扰效率。结果:PCR鉴定与DNA测序证实合成的寡核苷酸链插入正确,293T细胞测定病毒滴度为1×108TU/ml。Real-timePCR证实XBP1-siRNA-3靶点的干扰效率最高,其干扰效率达到95%以上。结论:成功构建并筛选了小鼠XBP1基因RNAi慢病毒载体,为研究XBP1在巨噬细胞免疫功能调控中的作用奠定了基础。
【关键词】 RNA干扰 XBP 慢病毒
【基金】国家重点基础研究发展规划项目(“973”项目)(2005CB522602) 全军医学科研“十一五”科技攻关项目(06G080)
【分类号】Q95-3
前言内质网在所有真核细胞分泌性蛋白和膜蛋白合成及修饰中起着重要作用,正常情况下,这些蛋白能在内质网腔内被正常折叠和组装,然而,当细胞内外环境发生紊乱时,未折叠蛋白或错折叠蛋白就会在内质网腔蓄积,诱发内质网应激(endo-的内含子,并发生翻译框移位,翻译产生具有转录活
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摘要 目的：构建小鼠XBP1基因RNA干扰(RNA interference，RNAi)慢病毒载体，筛选具有较好干扰效率的小鼠XBP1 siRNA靶序列。方法：针对小鼠XBP1基因特异性序列，设计4个RNAi靶序列及1个阴性对照序列，合成含有正义和反义Oligo DNA的互补DNA序列，退火形成双链DNA，并克隆到经Age I和EcoR I酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体，PCR筛选阳性克隆，DNA测序鉴定。由病毒包装系统进行包装，经滴度测定后感染NIH3T3细胞，应用Real-time PCR鉴定干扰效率。结果：PCR鉴定与DNA测序证实合成的寡核苷酸链插入正确，293T细胞测定病毒滴度为1×108TU/m1。Real-time PCR证实XBP1-siRNA-3靶点的干扰效率最高，其干扰效率达到95%以上。结论：成功构建并筛选了小鼠XBP1基因RNAi慢病毒载体，为研究XBP1在巨噬细胞免疫功能调控中的作用奠定了基础。
关键词：RNA干扰；XBP1；慢病毒
中图分类号：Q95-3，Q75，Q78 文献标识码：A 文章编号：1673—6273(2009)08—1401—04
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