构建一种精确表达小分子蛋白的技术平台
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周怡 王琪 黎丹戎 张玮 李力 广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科;
【摘要】目的:克服原核表达的小分子蛋白难以去除附加氨基酸的问题,为基因工程精确表达小分子蛋白提供一种简便有效的解决方案。方法:以73个氨基酸的小分子蛋白(黑色素瘤生长激活因子CXCL1的功能区)为例,用PCR方法扩增了基因,TA克隆到载体PETSUMO。测序验证后的重组质粒转化至表达菌BL21(DE3)中诱导表达,融合蛋白用基质辅助解吸电离飞行时间质谱仪进行串联质谱鉴定(MALDI-T0F-MS/MS),通过特异性的SUMO蛋白酶酶解载体SUMO蛋白,利用SUMO蛋白和其蛋白酶带6×His标签的性质,经镍螯合柱亲和层析将二者去除,以Western blotting证明目的小分子蛋白的分离。结果:①经测序,重组质粒无突变,TA克隆方向正确,重组载体构建成功。②MALDI-T0F-MS/MS证明融合蛋白由SUMO蛋白和CXCL1蛋白组成,除去SUMO蛋白后的表达终产物经Western blotting鉴定,与其相应的抗体有特异性结合,证明分离得到的小分子蛋白即为目的蛋白。结论:运用这一技术可将载体蛋白完全去除从而达到精确表达小分子蛋白的目的,在分子生物学的实验研究中有很好的应用前景。
【关键词】 小分子蛋白 TA克隆 SUMO蛋白 SUMO蛋白酶
【基金】国家自然科学基金项目(30560157) 广西自然科学基金(桂科基0639043,桂科青0640035)资助项目 研究生创新计划项目(2008105981002M182)
【分类号】Q75
前言在人工表达蛋白时,精确地表达出完整的成熟肽是实验者追求的最佳结果,表达产物中多余的蛋白片段可能影响后续的研究工作。尤其当研究对象为小分子蛋白时,相对大分子量的载体蛋白作为表达产物的主要成分,其空间构象有可能会影响目的片段正确折叠,其结构和抗原性也会成为对
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摘要 目的：克服原核表达的小分子蛋白难以去除附加氨基酸的问题，为基因工程精确表达小分子蛋白提供一种简便有效的解决方案。方法：以73个氨基酸的小分子蛋白(黑色素瘤生长激活因子CXCL1的功能区)为例，用PCR方法扩增了基因，TA克隆到载体PET SUMO。测序验证后的重组质粒转化至表达菌BL21(DE3)中诱导表达，融合蛋白用基质辅助解吸电离飞行时间质谱仪进行串联质谱鉴定(MALDI-T0F-MS/Ms)，通过特异性的SUM0蛋白酶酶解载体SUMO蛋白，利用SUMO蛋白和其蛋白酶带6x His标签的性质，经镍螯合柱亲和层析将二者去除，以Western blotting证明目的小分子蛋白的分离。
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