pWPT-GFP慢病毒载体的改构及鉴定
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韩腾龙 王立峰 张璟 刘新平 药立波 第四军医大学生物化学与分子生物学教研室;
【摘要】目的:为实现慢病毒感染后可用抗生素筛选外源基因稳定整合的细胞,我们对慢病毒载体质粒(pWPT-GFP)进行了改构。方法:将三种抗生素抗性基因(puro、hygro、neo)连同其启动子分别克隆入慢病毒载体(pWPT-GFP)。酶切鉴定载体构建正确后,将这三种改构载体分别与辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T包装细胞,收获病毒上清并感染靶细胞,使用相应抗生素筛选细胞验证抗性基因的插入。结果:成功构建了重组慢病毒载体pWPT-GFP-puro、pWPT-GFP-hygro、pWPT-GFP-neo,通过调整病毒上清的用量可以达到靶细胞100%的感染效率;用相应抗生素筛选细胞证明了抗性基因的表达。结论:我们成功改构了慢病毒载体(pWPT-GFP),从而使病毒感染后用抗生素筛选稳定整合的细胞成为可能。
【关键词】 慢病毒载体 改构 抗生素筛选
【分类号】Q75
前言由人类免疫缺陷病毒(HIV-1)改造而来的慢病毒载体,因其高效而稳定的基因转导效率已成为近来研究者们的常用选择[1,2]。为了在人正常二倍体成纤维细胞中实现外源基因的稳定整合,我实验室从美国Addgene网站订购了三质粒慢病毒包装系统。即通过将含有目的基因的载体质粒,和
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前言
由人类免疫缺陷病毒(HIV-1)改造而来的慢病毒载体，因其高效而稳定的基因转导效率已成为近来研究者们的常用选择。为了在人正常二倍体成纤维细胞中实现外源基因的稳定整合，我实验室从美国Addgene网站订购了三质粒慢病毒包装系统。即通过将含有目的基因的载体质粒，和包装质粒，包膜质粒共同转染包装细胞人胚肾293T细胞，在细胞上清中即可收获只有一次感染能力的慢病毒颗粒。但是该慢病毒载体质粒中并不含有任何真核细胞抗生素筛选标记，这就为感染后用抗生素筛选稳定整合的细胞造成了困难。为此我们对该慢病毒载体进行了改造，将三种抗生素抗性基因连同其启动子分别克隆人该慢病毒载体，包装病毒并感染细胞后，通过加入相应抗生素进行筛选证明了抗性基因的表达。重组的慢病毒载体为我们的下一步研究提供了方便，也希望我们对慢病毒载体的成功改构，能为同行提供值得借鉴的经验。
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