鹿亮，郭全义，杨启友，袁玫，张莉，黄靖香，赵斌，彭江，许文静，卢世璧

    天然脱细胞基质材料主要利用同种或异种器官(或组织)，经脱细胞、去除抗原处理后获得。天然细胞外基质(NECM)由细胞自身分泌，其围绕在细胞周围，主要含有胶原蛋白、纤维蛋白黏连素、层黏连蛋白以及层连素等。NECM 不仅为细胞提供支持结构和附着位点，而且对细胞的黏附、迁移、增殖、分化以及基因表达的调控都具有重要作用和显著影响。目前已有动物研究报道应用同种异体脱细胞材料成功修复了膀胱、尿道、动脉等组织[1-2]。但作为组织填充物，NECM 长期存在的生物安全性还有待进一步探讨。鉴于此，我们按照GB/T1688622003 标准[3]对猪来源关节软骨 ECM制备的支架进行生物安全性检测，旨在为组织工程软骨修复软骨缺损的临床应用提供实验依据。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    软骨细胞来源于解放军总医院膝关节置换手术切除的关节软骨标本(获得患者知情同意)。13个月龄的鲜猪四肢购自北京市屠宰场。健康新西兰大白兔[体重 2.0～2.5 kg，合格证号：SCXK(京 2007-0003)]和雌性、健康小白鼠[6～8周龄、体重 20～25 g，合格证号：SCXK(京 2006-2009)]由解放军总医院动物实验中心提供，均饲养于清洁普通环境中。胎牛血清(FBS)、DMEM 培养液、二甲基亚砜(dimethylsulfoxde，DMSO)、MTT 购自美国 Sigma公司，内毒素检测试剂盒(Cat#.295-51301)购自日本 Wako公司。MK3 型酶联免疫检测仪购自美国 Thermo公司，DU640 型紫外分光光度计购自美国 Beckman公司。

    1.2 方法

    1.2.1 支架的制备

    1.2.1.1 脱细胞软骨支架的制备 参照文献[4]的方法，切取猪四肢关节软骨，0～4 ℃ 浸泡于含苯甲基磺酰氟的PBS 中，超微湿法粉碎，充分稀释后4 ℃、差速离心，收集上清。加入 1% TritonX-100，4 ℃ 持续振荡 24 h 去除残余细胞成分，加入含有5×104U/L 脱氧核糖核酸酶及1×103U/L 核糖核酸酶的混合液，37 ℃ 过夜，去除核物质。4 ℃、10528×g 离心，收集沉淀，冷冻干燥制备成干冻干粉，加入稀盐酸(pH3.2)配制成浓度为2%的溶液。将此溶液注入聚乙烯圆筒模具中，冷冻干燥后取出支架，距光源 5～10cm处用波长 258 nm紫外线照射交联 2～8 h，再置于碳化二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺无水乙醇溶液中 4 ℃ 交联24 h ......