眭翔，郭全义，袁玫，崔雪梅，卢世璧

    肿瘤的免疫治疗在经历大量实验研究后已开始应用于临床，这也是提高肿瘤治疗效果的一个新途径，肿瘤的主动特异性免疫治疗(疫苗)和过继免疫治疗[如淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK 细胞)]均有一些临床试用的初步结果[1-3]，但其治疗效果尚不够理想。目前，联合应用各种免疫方法将有望提高肿瘤免疫治疗的效果，但免疫治疗后机体免疫系统可能会产生免疫负调作用，如调节性 T 细胞(Treg)的增加，所以如何克服这一负调作用也是现今免疫治疗面临并有待克服的问题。因此，为了提高肿瘤的免疫治疗效果，我们设计应用热休克蛋白/肽(mixed heat shock protein/peptides，mHSP/P)疫苗和重组人 IL-2(rhIL-2)加用低剂量环磷酰胺(cyclophasphade，Cy)对小鼠肉瘤进行联合免疫治疗，观察这种联合免疫对小鼠肉瘤疗效的增强作用。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    SPF 级 BALB/C 小鼠，雌性，6～8周龄，体重 18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[合格证号：SCXK(京)2000-0006]，按啮齿类动物饲养方法和条件饲养于我院 SPF 级动物房。小鼠肉瘤 S180 细胞由军事医学科学院王玉芝教授惠赠，取小鼠腹水中瘤细胞，液氮冷冻保存。rhIL-2 购自北京双鹿药业股份有限公司，Cy 购自江苏恒瑞医药股份有限公司，Sephacryl S-200HR凝胶层析柱购自瑞典 Amersham Biosciences公司。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞接种 S180 细胞按常规方法进行解冻、复苏，台盼蓝染色拒染法计数活细胞数 ≥ 95%。用 DMEM 培养液调整至 5×104/只，以 0.1ml 于小鼠背部皮下注射。

    1.2.2 疫苗分离制备 从 S180 细胞肉瘤组织分离混合 mHSP/P 疫苗，具体步骤为：①取小鼠皮下S180 细胞肉瘤组织，剪碎研磨，加入 10 倍体积的细胞裂解液(30 mmol/L NaHCO3、0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟，pH 7.1)，振摇破膜；②将上述获得的细胞裂解液于4 ℃、75000×g 离心 2.5 h，弃沉淀，取上清透析；③上 Sephacryl S-200HR 凝胶层析柱，加入分子筛洗脱液，分步收集，在相对分子质量(5～20)×104段截取收集洗脱液，即为混合mHSP/P 疫苗；④经 12% SDS-PAGE 分析后进行常规蛋白质印迹鉴定 ......