朱振洪，杨威威，葛立军，万海同

    MAP30 全长基因的克隆及在巴斯德毕赤酵母中的高效表达研究

    朱振洪，杨威威，葛立军，万海同

    310053 杭州，浙江中医药大学生物工程学院生物与制药工程教研室

    研究毕赤酵母中高效表达全长 MAP30 蛋白及其生物活性。

    根据 GeneBank 公布的 MAP30 全序列设计特异性引物，以苦瓜基因组为模板，PCR 扩增 MAP30 全长基因，将该基因插入 pPIC9k 载体中，经I酶切线性化后，电转化至 GS115 细胞，再通过 G418 筛选，最终获得了高拷贝重组 GS115 菌株。重组菌株在甲醇诱导下，SDS-PAGE 分析表达的特异性条带，运用Pharmacia VDS 图像分析软件进行条带密度扫描，得到各条带的扫描曲线图，计算出同一泳道目的蛋白条带峰面积相对于整个曲线所占的百分比，即蛋白纯度，并根据蛋白纯度和上清蛋白总量(Lowry 法)计算出发酵上清液中目标蛋白含量。纯化时首先用 75% 的饱和硫酸铵盐析，然后用 Phenyl Sepharose 6 FF 疏水层析，再用 CM-sepharose FF 阳离子层析。采用 MTT 法检测MAP30 蛋白对人胃癌细胞株 SGC7901 的抑制作用。为验证重组 MAP30 蛋白结构的正确性，采用 Edman 降解法分析末端 8 个氨基酸。

    重组菌株在甲醇诱导下，SDS-PAGE 分析可见相对分子质量 32 000 的特异性条带，重组蛋白占上清液总蛋白的 67%；发酵液经硫酸铵沉淀、疏水和阳离子交换层析后，目的蛋白总回收率为 32.4%。MTT 法检测结果表明，重组 MAP30 蛋白具有明显的抑制人胃癌细胞 SGC7901 的活性，IC50为 30mg/ml。端的 8 个氨基酸测序进一步证实与理论一致。

    重组 MAP30 蛋白在毕赤酵母中正确表达，表达产物具有抑制肿瘤细胞的活性。

    苦瓜； 核糖体蛋白质类； 毕赤酵母； 基因表达

    MAP30(momordica anti-HIV protein of 30 kD)是 1990 年 Lee-Huang 等[1]首次从苦瓜()果实和种子中分离得到的单链核糖体失活蛋白。MAP30 基因没有内含子，全长 861 bp，编码 286 个氨基酸，理论相对分子质量为 32 000，如果切除端 23 个氨基酸的引导肽，则 MAP30 蛋白为 263 个氨基酸，相对分子质量变为 30 000。其 51 ~ 53 位的 Asn-Leu-Thr 是连接糖基化位点 ......