李义良，易进华，夏佳慧，周文艳，范丽丽

    PCR引物浓度对寡核苷酸液相杂交的影响

    李义良，易进华，夏佳慧，周文艳，范丽丽

    201210 上海复旦张江生物医药股份有限公司

    考察 PCR 引物浓度配比对液相微珠杂交效率的影响，寻求具有较强杂交信号和较好稳定性的 PCR 引物浓度配比。

    建立 HLA-DRB1 等位基因的相关数据库，选择在 HLA-DRB1 位点的第二外显子上设计探针，并且选择其保守序列作为阳性对照探针(DPC2)，DPC2 探针中间位点 T 突变成 A 作为阴性对照探针(DNC)。分别针对标本 C2-008、C2-024、C2-025 的等位基因序列设计出 6 条约 21 bp 的寡核苷酸探针，各探针 5’ 端用氨基(NH2)修饰。通过引物浓度梯度配比(1:100、1:50、1:20、1:8、1:4、1:2、1:1)，对型别已知的细胞株 DNA 进行 PCR 扩增并得到目的片段(1:100 配比除外)，在相同条件下将 PCR 产物与寡核苷酸探针进行液相杂交检测。

    浓度配比为 1:1 的对称式扩增产物杂交结果不理想，而浓度配比分别为 1:20、1:8、1:4、1:2 的不对称扩增均得到了待检单链、双链 DNA 混合物，其中 1:4 浓度配比具有最好的扩增效率和稳定性。根据阳性信号与阳性标本是否相符表明：引物浓度配比为 1:100 的不对称 PCR 和 1:1 的对称 PCR 检测效果差，易出现假阴性；1:2、1:4、1:8、1:20 配比检测效果较好，比较稳定。

    PCR 引物浓度配比影响液相微珠杂交效率，不对称 PCR 产物有利于提高杂交效率，为快速成功配制 PCR 试剂奠定了基础，有利于寡核苷酸液相芯片的应用。

    聚合酶链反应； 寡核苷酸序列分析； 核酸杂交

    液相芯片是 20 世纪 90 年代中期发展起来的，以美国 Luminex 公司的 xMAP(flexible multi- analyte profiling)技术为基础，既能保证信息质量，又能提供相对高通量的新一代分子检测技术平台[1-2]。xMAP 液相芯片体系由许多不同颜色的微珠为主要基质构成，每种微珠表面共价连接有不同的寡核苷酸探针分子，将这些微珠悬浮于一个液相体系中，就构成了一个液相芯片系统。杂交在悬浮的液相中进行，空间位阻小，所需反应时间短，杂交后不用清洗就可以直接读数，检测效率大大高于固相杂交。xMAP 液相基因芯片已广泛应用于单核苷酸多态性分析[3]、组织相容性抗原分型[4]、基因表达分析等[5]研究 ......