张登禄，韩金祥，崔亚洲，周小艳

    胰腺癌转移相关基因 C14orf166 的真核表达及其蛋白相互作用的蛋白质组学筛选

    张登禄，韩金祥，崔亚洲，周小艳

    【摘要】

    目的旨在对胰腺癌转移相关基因 C14orf166 进行真核重组表达，并在此基础上结合蛋白质组学方法初步筛选其相互作用蛋白，为进一步研究 C14orf166 在肿瘤转移中的作用提供研究基础。

    方法构建人 C14orf166 的带双标签的真核表达载体pcDNA3.1-Flag-C14orf166-His，通过脂质体将其转染至人胚肾 293T 细胞。采用 Ni-agrose 进行 His 标签蛋白的pull-down 纯化，分离 C14orf166 的蛋白结合复合体，对蛋白混合物进行 SDS-PAGE 分析，选择差异条带，进行MALDI-TOF-TOF 质谱鉴定。

    结果在 293T 细胞中重组表达了 C14orf166 蛋白，对C14orf166 蛋白复合体进行分离鉴定后，筛选出 RS8、EFCB9 和 NRAP 3 个可能与 C14orf166 相互作用的蛋白。

    结论基因重组表达结合 pull-down 和蛋白质组学方法可以发现新的相互作用蛋白，为进一步了解 C14orf166 在肿瘤发病机制中的作用提供了新的线索。

    【关键词】胰腺肿瘤； 蛋白质组学； 基因表达

    www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2010, 5(3):186-190

    C14orf166 蛋白相对分子量约为 26 kD，广泛存在于人体各组织中[1]。我们在前期研究中通过定量蛋白质组学的方法首次发现 C14orf166 在转移的胰腺癌中高表达[2]，近期有研究进一步支持C14orf166 可能参与了胰腺癌的发病过程，但其机制尚不清楚[3]。

    本研究通过基因转染的方法在真核细胞中表达带标签的 C14orf166 重组蛋白，然后采用pull-down 的方法获得 C14orf166 蛋白及其相互作用蛋白的复合物，再利用蛋白质组学的方法对蛋白复合体进行成分鉴定，以期发现新的 C14orf166的相互作用蛋白，为进一步研究其促转移机制提供研究基础。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    实验所需大肠杆菌菌株 DH5α 和质粒pcDNA3.1(-) 均为本实验室保存；DMEM 培养基购自美国 Gibco 公司；限制性内切酶 Nhe I、Xho I、T4 连接酶、RT-PCR 试剂盒均购自日本 Takara公司；Protein A and G agrose 及鼠源的 His 标签抗体均购自德国默克公司；兔源的 C14orf166 单克隆抗体购自美国 Aviva 公司；鼠源的 β-actin 抗体购自美国 Abcam 公司；山羊抗鼠二抗和山羊抗兔二抗购自北京中衫金桥生物技术有限公司；Lipofectamine2000 购自美国 Invitrogen 公司；Ni-agrose 购自北京康为世纪生物科技有限公司 ......