何红伟，李保卫，任开环，邵荣光

    RNA 干扰(RNAi)技术是一种非常有潜力的疾病治疗手段，具有干扰特异性高、可同时干扰多个基因的特点[1-3]。与化学合成小干扰 RNA(siRNA)及短发夹 RNA(shRNA)病毒表达载体法相比，shRNA 非病毒表达载体法介导的多靶点RNAi 操作简便、成本低、干扰效果稳定且安全性高[4]。但 shRNA 表达质粒有时可以促发干扰素效应，这种非特异性作用与浓度有密切关系，在需要同时抑制两个或多个基因时往往受到很大的限制。所以本研究设计并构建了一种可用于同时表达两种 shRNA 的载体 pCSH1，在对两个靶基因产生有效的特异 RNA 干扰的同时降低载体的用量，从而减少非特异性作用。

    1 材料与方法

    1.1 主要材料

    质粒 pUC19，人肝癌 HepG2 细胞本室保存；pSilencer H1 3.0 购自美国 ambion 公司；TRIzol、RT-PCR 试剂盒购自美国 Invitrogen 公司；N-Ras、c-Myc、β-actin 单克隆抗体均购自美国 Santa Cruz公司。

    1.2 方法

    1.2.1 可同时表达多种基因 shRNA 的载体pCSH1 的设计与构建 为了实现将两个 shRNA转录单位串联在一个载体上的目的，利用同尾酶的特性，需要在 shRNA 转录单位两侧选择一对同尾酶和设计两组多克隆位点(KSEE、HXEP)，使这两组多克隆位点与 shRNA 表达转录单位、pUC19的质粒序列有序组合，构建成质粒载体。根据以上设计思路，需人工合成两对引物，每对引物对应一个多克隆位点。合成的引物序列分别为：KSEEa：5’ AAT TGG TAC CGT CGA CGA TAT CG 3’，KSEEas：3’ CCA TGG CAG CTG CTA TAG CTT AA 5’，HXEPa：5’ AGC TTC TCG AGA TAT CTG C 3’，HXEPas：3’ AGA GCT CTA TAG ACG TCG A 5’。KSEEa 和 KSEEas 可以退火形成双链，双链上含有 Kpn I、Sal I、EcoR V 和 EcoR I 共 4 个酶切位点；HXEPa 和 HXEPas 可以形成双链，双链上含有 Hind III、Xho I、EcoR V 和 Pst I 共 4 个酶切位点。这两对引物退火形成双链后，将 pUC19 质粒片段和 pSilencer H1 3.0 中的 H1 启动子片段共 4 个片段连接起来 ......