曹娜娜，黄红兰，赵春燕

    ·技术与方法·

    电子基因芯片 DNA 等温扩增技术检测大肠埃希菌 O157∶H7 方法建立

    曹娜娜，黄红兰，赵春燕

    Nanogene 公司研制的电子基因芯片利用电子场、热循环或化学技术等吸引带负电的 DNA、RNA 或其他生物分子和探针结合到芯片特定位点上进行杂交检测[1]。Nanogene电子芯片具有精确性和严谨性，对生物分子的电子吸引力大大加速了分子结合到芯片上的速度，与传统的被动式芯片(如 Affymetrix、Genechip)相比，提高了 1000 倍以上。通常被动式芯片的点样需要花几个小时，而主动式电子芯片仅需要 30 ～ 60 s。

    我们曾建立了一种等温网状分枝扩增技术(ramification amplification method，RAM)，该方法利用环形探针和捕获探针分离和检测靶序列，当环形探针与靶基因结合时，在连接酶的作用下以共价键连接成环状。然后，延着环形探针聚合酶延伸连接的正向引物，置换下游链，产生多聚 ssDNA，这个过程类似噬菌体体内复制过程。再以多聚 ssDNA 作为模板，反向引物与它杂交、延伸、置换下游链，产生大的分枝复合物，导致指数级扩增，整个反应在等温条件下进行[2]。RAM 具有和 PCR 一样的灵敏度，而且等温扩增不需要温度循环仪，在任何条件下均可进行扩增反应。在本实验中，我们将 RAM 方法与电子芯片有机结合起来，在电子芯片上进行 RAM 扩增，以大肠埃希菌的产志贺样毒素 O157志贺毒素基因 2(shiga toxin 2，stx2)作为检测靶基因，确定该方法的可行性，使电子芯片技术有更广泛的应用前景。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株来源 从临床标本和食品中分离的 33 株菌株，其中 E.coli O157∶H7 23 株，E.coli O26∶H11 2 株，E.coli O111∶NM 1 株，痢疾志贺菌 3 株，血清型未确定的 4 株，分别由美国马里兰大学和中国疾病预防控制中心流行病所惠赠及本室分离鉴定保存；大肠埃希菌 ATCC23716 作为阴性对照菌株。

    1.1.2 试剂 异硫氢酸胍、0.5% 牛血清白蛋白、0.5% 十二烷基钠、组氨酸缓冲液、DMSO 均为美国 Sigma 公司产品；Taq DNA 连接酶、Bst DNA 聚合酶为美国 New England Biolabs 公司产品；T4 Gene 32 蛋白为美国 United States Biochemical 公司产品；dNTP 为北京鼎国生物技术有限责任公司产品；EDTA 为美国 Gibco 公司产品；Tris 为长春宝泰克生物科技公司产品 ......