刘广鹏，孙剑，李宇琳，周恒，崔磊

    脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells，ASCs)是存在于脂肪组织中的一类成体干细胞，可以向中胚层多种细胞分化[1-2]。近年来的研究表明，因获取时对机体损伤小、培养扩增后数量充足、且自体细胞避免了免疫排斥反应等特点，ASCs 已经成为骨组织工程种子细胞的重要来源之一[3]。本实验室在运用组织工程技术修复大动物骨缺损的研究基础上，建立了一套完整的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因标记技术，可以直接追踪 GFP 标记的细胞在体内的分化与转归，为组织工程研究提供了一种简便、灵敏、可靠而又直观的细胞标记示踪方法[4]。本实验则针对低温保存是否会对 GFP 标记的 ASCs 接种支架材料后的体外生长特性及成骨能力产生影响进行了相关的研究，以期为验证低温保存后的 ASCs 作为组织工程骨种子细胞的可行性提供实验依据。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要试剂 GFP 逆转录病毒由本实验室自行构建[5]；PT67 包装细胞为美国 Clotech 公司产品；G418 培养液为上海华舜生物工程有限公司产品；DMEM 低糖培养基为美国 Hyclone 公司产品；胎牛血清购自美国 Gibco 公司；I 型胶原酶、地塞米松、β-甘油磷酸钠、2-磷酸抗坏血酸、Hoechst 33258 荧光染料、二甲基亚砜(DMSO)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性检测试剂盒均购自美国 Sigma 公司；骨钙蛋白(osteocalcin，OCN)含量检测试剂盒购自美国 Biomedical Technologies 公司。

    1.1.2 试验动物 纯种 Beagle 犬 4 只，1 岁龄，雌雄不限，体重 15 ～ 18 kg，上海农学院提供。

    1.2 方法

    1.2.1 犬 ASCs 的分离和培养 1 岁龄 Beagle犬 4 只，雌雄不限，麻醉后无菌条件下取腹股沟皮下脂肪组织约 15 g。将脂肪组织充分剪碎后，以0.075% 的 I 型胶原酶 37 ℃ 振荡消化 25 min。1500 × g 离心 10 min，收集沉淀细胞，以 4 ×104/cm2密度接种于直径 100 mm 细胞培养皿中，加入含 10% 胎牛血清的低糖 DMEM 培养液，37 ℃、5% CO2、100% 湿度条件下常规培养。24 h后首次换液，以后每周换液 2 次 ......