于彦婷，任丽，孙春玉，蒋世翠，王义，张美萍

    人参SQE基因干扰载体的构建及转化

    于彦婷，任丽，孙春玉，蒋世翠，王义，张美萍

    目的探讨SQE基因对人参皂苷合成的影响。

    方法根据SQE基因保守区序列，分别设计合成其正反义片段引物行 RT-PCR 扩增，扩增产物分别与 pMD18-T 质粒连接后转化E.coliDH5α，获得的 pMD18-T-SQE-S、pMD18-T-SQE-A 重组质粒经双酶切后，将正反义片段与质粒 pMHZ112 反向连接，转化E.coliDH5α，构建SQE基因 RNAi 双元表达载体 pMHZ112-SQE。电击法将鉴定正确的重组质粒 pMHZ112-SQE 转化农杆菌 GV3101 感受态细胞，再利用农杆菌介导法转化人参愈伤组织，提取抗性人参愈伤组织细胞基因组 DNA，进行 PCR 检测并计算抗性愈伤转化率；同时提取人参皂苷，采用 HPLC 方法检测抗性人参愈伤组织的皂苷含量。

    结果结果显示总 RNA 较完整无降解，质量较好；RT-PCR扩增产物正反义片段大小与预期一致；重组质粒pMD18-T-SQE-S、pMD18-T-SQE-A 和 pMHZ112-SQE 分别经双酶切进行测序鉴定，结果表明目的基因已插入重组质粒且连接方向正确。人参愈伤组织细胞基因组 DNA 的PCR 检测结果显示 1 个菌落经 2 对引物扩增结果均呈阳性，证明构建的 pMHZ112-SQE 重组质粒已成功整合入植物基因组中，其抗性愈伤转化率为 1%。转化 pMHZ112-SQE重组质粒后，人参抗性愈伤组织中单体皂苷 Rg1、Re、Rc 含量明显下降，Rb1 略有升高，实验组与对照组(转化空质粒)间 Rg1、Re、Rb1、Rc 的含量差异显著(均P< 0.05)；而 2 组均未检测出 Rb2 和 Rd。

    结论成功构建了SQE基因 RNAi 双元表达载体，通过转化人参愈伤组织抑制SQE基因的表达，可以调控人参皂苷含量发生相应的改变。

    人参； 基因； 药物载体； 皂苷类

    鲨烯环氧酶(squalene epoxidase，SQE)是一种单加氧酶，它是三萜皂苷生物合成途径中的关键酶之一，其基因所编码的酶可催化鲨烯(squalene)生成 2,3-氧化鲨烯[1]。SQE 主要作用于单氧态氧化鲨烯生成 2,3-氧化鲨烯，2,3-氧化鲨烯是植物体内甾体、皂苷、倍半萜等许多萜类衍生物质的合成前体，这些物质在植物的生长发育或抗病过程中具有重要作用。据目前研究表明，SQE基因在不同物种中均有表达[2-4] ......