李薇，刘晓萍，徐祥，谭艳，于业军，李艳君，任书亭，贾跃伟

    为了进一步研究 Ubc9 对细胞功能的影响，我们构建带有红色荧光标记(RFP)的含 Ubc9 基因的腺病毒载体，观察 Ubc9 在 HeLa 细胞中的表达情况，为今后研究 Ubc9 的功能提供一个工具。

    1 材料与方法

    1.1 质粒、菌株和主要生化试剂

    穿梭质粒 pAdTrack-TO4、腺病毒骨架质粒pAdeasy-1、pCMV6-XL6-Ubc9 质粒、大肠杆菌DH5a、BJ5183 及腺病毒包装细胞 HEK293 细胞由第三军医大学大坪医院外研所赠予；转染试剂PolyJetTM购自美国 SignaGen 公司；质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒以及 DNA 标记物购自北京康为世纪生物科技有限公司；无内毒素质粒大量制备试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；DMEM 培养基、血清、胰蛋白酶购自美国 Gibco公司；限制性内切酶、T4 DNA 连接酶购自大连Takara 公司；琼脂糖及各种生化制剂由凌飞公司进口分装；PCR 引物由上海生工公司合成；基因测序由上海英潍捷基有限公司完成。

    1.2 方法

    1.2.1 PCR 法扩增目的 Ubc9 基因 以 pcmv6-xl6-Ubc9 质粒为模板进行 PCR 扩增。在引物中分别引入 BamH I 和 Xho I 的酶切位点，上游引物：5’ GGATCCATGTCGGGGATCGCCCTCAG 3’；下游引物：5’ TCCGCTCGAGTTATGAGGGCGCAAA CTTC 3’。PCR 反应参数：94℃预变性 2min，94℃变性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，循环 30 次，最后 72℃延伸 5min。PCR 产物经 2%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得目的片段。

    1.2.2 腺病毒穿梭质粒 pAdTrack-CMV-Ubc9 的构建 将 PCR 扩增的 Ubc9 基因产物和带有RFP 的穿梭质粒 pAdTrack-CMV 分别以 BamH I和 Xho I 进行双酶切，经 2%琼脂糖凝胶电泳鉴定并纯化回收 Ubc9 片段及 pAdTrack-CMV 穿梭质粒。用 T4 DNA 连接酶过夜连接，转化大肠杆菌 DH5a。挑选转化菌落，小量快速提取重组质粒。通过限制性酶切和测序分析进行鉴定。同时，以不含目的基因 Ubc9 的穿梭质粒 pAdTrack-CMV 作为载体对照。

    1.2.3 含有 pAdEasy-1 的 BJ5183 菌的制备 挑取单一克隆 BJ5183 菌接种在含 LB 培养基摇瓶中 ......