杨月峰，王华，肖凤君，徐洁，李庆芳，严俊，王立生

    我国前列腺癌(prostate cancer，PC)的发病率呈现逐年上升趋势，悄悄影响着老年人口的生活质量和预期寿命[1-2]。PC 的发病与机体免疫抑制或耐受相关，包括特异性和非特异性免疫被阻断[3]。而抗原递呈功能不足是导致肿瘤患者免疫抑制状态的最重要因素，以致即使产生效应细胞，也很难识别和杀死肿瘤细胞[4]。树突状细胞(dendritic cell，DC)是已知体内功能最强、唯一能活化静息 T 细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。目前，通过多种策略制备的 DC疫苗取得了令人鼓舞的结果[5-7]。

    CD40-CD40L 是特异性免疫反应系统的一对重要共刺激分子。研究表明，CD40L 与肿瘤抗原融合表达，能通过 CD40L 的靶向作用将肿瘤抗原带到 DC 表面，进而激活机体特异性抗肿瘤免疫反应[8]。而粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)能有效促进 DC 的成熟和分化[9]。本研究将构建携带融合蛋白基因 PSA-IZ-mCD40L(PmL)和 GM-CSF基因的重组质粒载体 pUDK-PmL-IR-GM，并探讨其小鼠体内免疫激活作用。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 实验动物 健康二级 Balb/c 雄性小鼠20 只，4～6 周龄，体重：(21.32±2.19)g。由军事医学科学院医学动物中心提供，合格证号：SCXK-(军)2007-004，饲养于军事医学科学院 SPF级动物房。

    1.1.2 质粒、菌株和细胞 pUDK 为本实验室自行设计并构建的基因治疗质粒载体；pUDK-HmLIR-GM 为携带乙肝病毒(HBV)抗原多肽、mCD40L融合蛋白基因和 GM-CSF 基因的质粒载体；pUDK-mL-IR-GM 为携带 mCD40L 和 GM-CSF 基因的质粒载体；TE-SV-IR-TP-55K 为携带人源 GM-CSF(hGM-CSF)基因的 T 载体，以上质粒载体均由本实验室保存。DH5a 感受态细胞购自北京博大泰克；人 PC 细胞系 LNCaP 购自北京协和细胞库；人肝癌细胞系 HepG2 为本实验室保存。

    1.1.3 工具酶及主要试剂 限制性内切酶 ApaI、KpnI、EcoRV、BglII、EcoRI、NotI 和 XbaI，λ-HindIII Marker 购自日本 TaKaRa 公司；高保真 DNA 聚合酶 KOD-Plus 试剂盒购自日本 TOYOBO 公司；T4 DNA 连接酶购自美国 NEB 公司；cDNA 第一链合成试剂盒 M-MLV、脂质体 2000、D2000 Marker、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒购自北京 TIANGen 公司；ConA、MTT、RPMI1640 和 DMEM 培养基购自美国 Sigma 公司；FBS 购自美国 Hyclone 公司和北京元亨圣马生物技术研究所；G418 购自德国 Merck 公司；流式检测抗体 PE-anti-CD3、FITC-anti-CD4、APC-anti-CD8 和 PE-anti-B220 购自美国 Biolegend 公司；人 GM-CSF ELISA 检测试剂盒购自北京晶美公司；Trizol 试剂购自美国 Invitrogen 公司；细胞杀伤检测试剂盒 CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay 购自美国 Promega 公司；羊抗鼠 CD40L 抗体购自美国 R&D 公司 ......