谢俊，许淼，龚秀丽，曲立娟，颜景斌，黄英

    自 1982 年世界上首次通过转基因动物技术获得“巨鼠”[1]以来，转基因动物的研究发展迅速。随着多种转基因动物的成功获得，研究者设想利用动物表达外源基因，以动物个体作为一个反应器来生产有价值的蛋白质。由于动物乳腺作为外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不影响转基因动物本身生理代谢反应；并且外源蛋白产量高，易提纯，经充分修饰加工，具有稳定的生物活性，因此乳腺生物反应器显示了很好的应用前景。目前，百余种多肽类药物、疫苗、抗体、酶制剂等已在不同种动物乳腺生物反应器中表达，其中近 30 种重组蛋白产品药物已进入临床试验不同阶段，如用于治疗抗凝血酶缺乏症的抗凝血酶 III 已上市[2]。然而，在乳腺生物反应器研发过程中，外源基因表达不高和整合位点的多样化一直制约着乳腺生物反应器的研发进度。在前期的研究中，本研究所构建了乳腺特异启动子调控的人转铁蛋白(human transferrin，hTF)表达质粒，通过原核法获得了表达水平较高的转基因小鼠，但这些转基因小鼠中转铁蛋白的表达却出现了明显的差异(未发表数据)。由此猜想，外源基因的不同表达水平与外源基因的整合位点情况有关，即与整合时插入位点直接相关，造成位置效应影响[3]。因此，本文试图通过分析不同表达水平转基因小鼠外源基因的整合位点旁侧序列情况，探讨转基因整合位点与其表达效应之间的关系，为寻找高表达位点以构建定点整合载体来制备转基因动物提供有指导价值的理论和技术基础。

    通常进行转基因整合位点的研究是采用染色体步移技术，而在众多染色体步移方法中，反向 PCR(inverse PCP，IPCR)是应用最早，也是最常用的方法之一[4]。由于靶序列在质粒、细菌基因组中丰度较高，易扩增，因而用反向 PCR技术获得质粒及细菌基因组的旁侧序列较为简单，但是，当用反向 PCR 扩增哺乳动物细胞基因组导入的外源基因序列旁侧片段时，由于待扩增的靶序列在基因组中往往含量极微量，再加上连接效率有限，很难一步直接得到所需片段[5]。本文通过优化和改进反向 PCR 的技术中各个环节，成功获得了不同表达水平的 hTF 转基因小鼠旁侧序列，这为整合位点的序列结构和调控元件分析研究及制备乳腺特异、高表达转基因动物的技术平台奠定了基础。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 试剂 限制性内切酶和 T4 连接酶、LATaq 酶、载体 pMDl9T、dNTPmix 等均为日本 Takara 公司产品；凝胶回收试剂盒、感受态细胞 TOP10 为本所保存；GeneRulerTM1 kb DNA ladder 为美国 MBI 公司产品 ......