支晓慧，王丽娜，朱平，王伟，孔建强

    酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，S.cerevisiae)是一种背景清楚，生长迅速，繁殖简单的单细胞真核生物，很早就作为外源蛋白诱导表达以及代谢工程的宿主菌使用。

    在酿酒酵母表达系统中，使用最为广泛的载体分别是附加体型载体(yeast episomal plasmid，YEP)和整合体型载体(yeast integration plasmid，YIP)。其中，YEP 型载体由于含有自主复制序列，在酵母中能独立存活，拷贝数较高；但如果没有选择压力，随着酵母的生长和繁殖，这类质粒会出现丢失的现象，稳定性较差。YIP 型载体不含酵母复制子，因此，不能在酵母中单独存活，必须整合到酵母基因组上才能发挥功能[1]。这类整合载体在酵母中的整合是高特异性的，很稳定，因此，在以酿酒酵母为宿主菌的天然产物合成生物学研究中，酿酒酵母整合体型载体得到了广泛地应用[2-4]。但由于整合体型载体拷贝数较低，致使目的基因的表达水平不高，目的产物含量达不到工业化生产的水平[3]。因此，构建一些高拷贝的整合体型载体对于天然产物合成生物学的研究显得十分必要。

    核糖体 DNA(ribosomal DNA，rDNA)序列是指细胞核中编码核糖体 RNA的DNA 序列，它是一段高度重复序列，其重复单位由转录区段和非转录区段组成。在酿酒酵母的XII 染色体中，rDNA存在100～140个重复单位[5]。如果以酿酒酵母rDNA 序列为整合位点，从理论上说，可以得到100～140个目的基因拷贝数。因此，本实验基于rDNA 序列，构建了一个以 rDNA 序列为整合位点的酿酒酵母整合体型载体，并通过该载体，将青蒿紫穗槐-4,11-二烯合酶基因整合到酿酒酵母 rDNA序列上。GC-MS结果表明，该工程菌确实能产生紫穗槐-4,11-二烯，表明紫穗槐-4,11-二烯合酶基因已经整合到了酿酒酵母上。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 工具酶和试剂 T4 DNA 连接酶、限制性内切酶和Taq DNA 聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司；克隆质粒 pGEM-T 购自美国 Promega公司；胶回收试剂盒购自加拿大 BBI公司；酵母基因组和质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；朱栾倍半萜(valencene)标准品购自美国 Fluka公司；5-氟乳清酸(5-FOA)购自美国 Sigma公司；正十二烷购自日本 TCI公司；其他试剂均为分析纯。 ......