纪潇朗，于冰，金华，周祥，徐春秀，石玉，李祎亮

    表皮生长因子受体(EGFR)是一种具有酪氨酸激酶(PTK)活性的跨膜糖蛋白受体，由 N 端胞外区、跨膜区、胞内区 3 部分组成，胞内区共 542 个氨基酸残基，由近膜区、酪氨酸激酶区、C 末端等 3 个亚区构成，近膜区的前13 个氨基酸(645～657)介导胞内二聚化[1]。自身磷酸化位点位于 C 末端，其中 Tyr1068 为最主要的 3 个磷酸化位点(Tyr1068、Tyr1148 和 Tyr1173)之一，与细胞信号传递密切相关[2]。表皮生长因子(EGF)与 EGFR 胞外区 N 端结合，受体之间二聚化形成同源或异源二聚体，二聚体促使EGFR 胞内区氨基酸残基自磷酸化，进而启动胞内信号通路，调控癌细胞的增殖、存活及凋亡[3]。

    EGFR 的信号转导通路在肿瘤的形成和发展过程中占据重要地位，已成为肿瘤药物治疗的一个理想靶标。目前，利用 EGF 诱导 A431 肿瘤细胞，定量检测肿瘤细胞膜上EGFR 的 Tyr1068 位点磷酸化水平的 cell-based ELISA 筛选方法文献报道较少，基于作用机制的分析，本文选用EGFR 高表达的 A431 细胞系，EGFR(Tyr1068)自身磷酸化为主要的特异检测指标，确立了 EGF 诱导 A431 细胞磷酸化的筛选条件，并用此方法系统评价了已上市的酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)以及自研的新活性化合物对 EGFR(Tyr1068)磷酸化的抑制活性，实验结果具有较好的重现性和准确性。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 药物与试剂 EGF 细胞因子购自以色列 ProSpec公司；37% 甲醛、双氧水购自美国 Sigma 公司；ELISA cell based Kit 购自美国 R & D 公司；无菌去离子水购自美国Amresco 公司；胎牛血清购自美国 Hyclone 公司；DMEM高糖培养基购自美国 Gibco 公司。

    1.1.2 主要仪器 Costar 黑色透明底 96 孔板购自美国Corning 公司；SMP500-15418-QWGI 型酶标仪购自美国Molecular Devices 公司。

    1.1.3 细胞株 A431 细胞购于北京协和医学院细胞中心。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞的培养、诱导及固定 细胞使用含有 10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 链霉素的 DMEM 高糖培养基 ......