史彦薇，王志芳，王伟，安建梅，孔建强

    红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)是从珊瑚纲生物中分离出来的一类与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)同源的荧光蛋白，其在紫外光的照射下可发射红色荧光[1]。自 1999年首次被分离出来至今，红色荧光蛋白以其激发和发射波长较长、细胞内成像背景低、细胞毒性小而备受关注并广泛应用。迄今为止，红色荧光蛋白已经拥有多种突变体[2-10]，与最初的红色荧光蛋白相比，突变体红色荧光蛋白在成熟时间、荧光强度、发射波长以及聚集程度方面均有很大改观，同时更多成熟时间短[2-4]、荧光强度强[5-7]、发射波长更长的单体红色荧光蛋白[8-10]也得以成功开发应用。不仅如此，红色荧光蛋白性能的改善还使其更多地被用于分子标签[11-13]以及蛋白相互作用[14-16]的研究。为了更好地拓宽红色荧光蛋白的应用领域，本实验尝试将红色荧光蛋白 Dsred 基因导入酿酒酵母菌，实现红色荧光蛋白在酿酒酵母菌体内的异源表达；同时为缩短红色荧光蛋白的成熟时间，对缺水环境中红色荧光蛋白的表达特性进行了分析，以期为红色荧光蛋白更好地应用于双分子荧光互补(bimolecular fluorescent complementary，BiFC)[14-16]等蛋白互作技术研究提供实验依据。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 质粒与菌株 大肠杆菌菌株 E.coli TG1 和酿酒酵母菌株 W303-1B(MATa；ade2-1；his3-11,his3-15；leu2-3, leu2-112；ura3-1；trp1-1)均为本实验室保存；pMD18-T 载体购自宝生物工程(大连)有限公司；pYeDP60 酿酒酵母表达载体为法国Werck-Reichhart 教授馈赠。

    1.1.2 试剂与仪器 KOD Plus 高保真 DNA 聚合酶购自日本 Toyobo 公司；鲑鱼精 DNA 购自日本 Wako 公司；聚乙二醇(PEG4000)购自北京欣经科生物技术有限公司；醋酸锂和伴刀豆球蛋白购自美国 Sigma 公司；酵母质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；快速连接试剂盒 In-fusionTMAdvantage PCR Cloning Kit/Cloning Enhancer Kit 购自美国 Clontech 公司；蛋白Marker 购自立陶宛 Fermentas 公司；其他试剂均为分析纯。

    LB 大肠杆菌培养基(含 10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L NaCl；固体培养基添加1.5% 琼脂粉)购自德国 Merck 公司；YPD 酵母培养基(含 10 g/L 酵母提取物、20 g/L 细菌蛋白胨、20 g/L 葡萄糖；固体培养基添加 2% 琼脂粉)和 YPG 酵母诱导培养基(含 10 g/L 酵母提取物、20 g/L 细菌蛋白胨、20 g/L 半乳糖)购自英国Oxoid 公司；SCD 酵母胁迫培养基(含 7 g/L 无氨基酵母氮源、2 g/L drop-out 混合物、20 g/L 葡萄糖；固体培养基添加 2% 琼脂粉)、SCG 酵母胁迫诱导培养基(含 7 g/L 无氨基酵母氮源、2 g/L drop-out混合物、20 g/L 半乳糖)和 SC-Ade-Ura 培养基购自北京欣经科生物技术有限公司 ......