文川，赛岩，白纪民，刘勇，常菁，王智，崔春萍

    原发性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是居全球第 5 位的常见肿瘤，是严重危害人类健康的重大疾病[1]。近年来研究表明，原发性肝癌发病率呈上升趋势，2010年数据显示我国每年死于肝癌的人数约 34.4万人，占全世界肝癌死亡人数的55%。肝癌切除后易复发，对化疗药物不敏感，缺乏有效的系统治疗策略，且在治疗过程中容易产生耐药和复发，导致治疗失败。因此，深入研究肝癌发病机制并发展新的治疗策略是关系人类健康的重大科学问题。

    HPPCn(Hepatopoietin Cn)是本室从新生小牛肝脏中分离得到的一种新型肝细胞刺激因子[2]，在肝癌细胞中呈高表达，在肝癌患者的癌组织和血清中表达呈阳性。前期研究发现 HPPCn能够特异促进肝细胞的DNA 合成和肝脏再生。为了进一步对HPPCn的功能进行研究，我们构建了携带小鼠白蛋白启动子(Alb promoter)和增强子序列的HPPCn肝脏特异性表达载体，并获得了肝脏高表达HPPCn的转基因鼠，为研究 HPPCn 在肝癌发生过程中的功能奠定基础。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 实验动物 4周龄 SPF 级 FVB/N 小鼠，军事医学科学院实验动物中心提供。所有实验用小鼠均在SPF 级动物房饲养和繁殖。温度控制在22 ℃，湿度 70 %，自动光控(12 h 明/12 h 暗)，自由采食和饮水。

    1.1.2 主要试剂 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DL2000、Xhol I、Not I、BamH I、Pst I 购自中国宝生物工程(大连)有限公司；DNA 回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自美国 Qiagen公司；T4DNA连接酶、荧光定量 PCR 反应 Mix、反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；PVDF 杂交膜购自美国 Amersham公司；Hybond+尼龙膜购自美国 Millipore公司；抗 HPPCn 单克隆抗体由本实验室自制；地高辛标记试剂盒购自美国罗氏公司；TRIzol 试剂购自美国 Invitrogen公司；基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；所有引物均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

    1.2 方法

    1.2.1 携带 HPPCn 重组质粒的构建及转基因小鼠的制备 将 pGEX 载体中的CMV 启动子替换为A1bumin 启动子和增强子序列。该质粒是在限制性内切酶 Xho I、Not I 之间插入了带有 7个组氨酸标签的HPPCn ......