康可人，吴培钿，卢艳华，张健，唐时幸，王继华

    D-二聚体单克隆抗体制备及其在免疫荧光快速定量检测中的应用

    康可人，吴培钿，卢艳华，张健，唐时幸，王继华

    D-二聚体(D-dimer，D-D)是纤维蛋白单体经活化因子 XIII 作用后形成的交联纤维蛋白凝块，再经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物，医学应用上将它作为一个特异性的纤溶过程标记物，反映纤维蛋白溶解功能[1]。与纤维蛋白破坏有关的疾病，如深静脉血栓形成(DVT)、肺栓塞(PE)和弥漫性血管内凝血(DIC)等，均可导致体内 D-D水平升高[2-6]。近年来 D-D 的临床应用范围越来越广，除了以上提及的疾病外，在恶性肿瘤、糖尿病、肝脏疾病、脓毒血症的诊断以及溶栓治疗监测方面均具有重要的参考价值[7-9]。

    目前 D-D 蛋白检测方法主要有胶体金法、酶联免疫吸附法(ELISA)和第二代胶乳凝集法(免疫比浊法)[10]。胶体金法快速简单，但无法实现定量检测；ELISA 法可精确定量，但操作步骤繁琐；免疫比浊法敏感性高，检测结果准确，但试剂以进口为主[11]。荧光免疫定量检测技术，属于即时检测(point-of-care testing，POCT)[12]领域的新兴技术，能快速、灵敏、简便地实现指标的定量检测，免疫荧光定量检测技术经过一定阶段的发展，目前主要在感染性指标(如C 反应蛋白)和心脏标志物指标的应用上较为多见，厂家以欧美、韩为主。本研究利用杂交瘤技术制备筛选能稳定分泌特异性抗 D-D 抗体的细胞株，初步应用于免疫荧光定量检测平台，实现对 D-D 快速定量检测，为临床相关疾病的诊断、治疗、监测提供有效工具与手段。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 试剂及动物 人源 D-二聚体蛋白购自英国 Abcam公司；纤维蛋白原购自北京博润莱特科技公司；人纤溶酶、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、小鼠单克隆抗体亚型检测试剂盒均购自美国 Sigma 公司；RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)、HAT、HT、聚乙二醇(PEG)(Mw 4000)均为美国 Gibco 公司产品；羊抗鼠 IgG-HRP酶购自北京中杉金桥公司；纤维蛋白原降解物(纤维蛋白解复合物、D 和 E 片段)由本室制备保存；小鼠骨髓瘤细胞系(SP2/0)为本实验室传代保存；实验室用水为超纯水；所用化学试剂均为国产分析纯。SPF 级 BALB/c 纯系小鼠，鼠龄 6 ～ 8 周，体重 18 ～ 22 g，由中山大学实验动物中心提供 ......