孙银玲，贺晓波，李永臻，孙海峰

    诺卡菌属菌株04-5195发酵产物5195B的分离鉴定及其体外抗骨质疏松活性研究

    孙银玲*，贺晓波*，李永臻，孙海峰

    近年来研究证实，增强成骨细胞作用、改善骨质形成代谢、促进骨质形成是治疗骨质疏松新的更为重要的途径。成骨细胞的增殖和分化受多种因素调节，其中骨形态形成蛋白家族尤其是骨形态形成蛋白 II(BMP2)在成骨细胞分化过程中起着关键作用，其作为骨形成诱导因子有望成为骨质疏松治疗的新靶点。

    本课题组在前期工作中，成功构建了以bmp2启动子为靶点、含有萤火虫荧光素酶报告基因的稳定转染细胞模型。将在荧光素酶报告基因上游克隆有bmp2基因上游调控序列的重组质粒 pGL4-bmp2转染至小鼠颅骨细胞MC3T3-E1，经 G418 筛选得到单克隆稳定转染细胞株bmp2-Luc MC3T3，利用已知的活性化合物验证和优化该bmp2上调剂筛选模型，证明其良好的特异性、灵敏度和稳定性均符合高通量筛选模型的要求。应用该模型对微生物产物馏分库进行筛选，得到能产生高活性物质的菌株04-5195。通过对 04-5195 的形态特征鉴别、生理生化指标判别、DNA 序列比对及系统发育分析结果证明其为诺卡菌属的新种菌株[1]。对 04-5195 菌株发酵产物通过正相层析分离得到了化合物 5195A，经鉴定为 Amicoumacin B[2]，但其并非主要活性组分。本工作采用新的分离工艺流程对菌株发酵产物重新分离，得到 5195B，经鉴定为大豆素(daidzein)，体外研究证明其具有上调 BMP2 表达和促成骨细胞分化的作用。

    *同为第一作者

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    1.1.1 菌株 诺卡菌属新种菌株 04-5195 由中国医学科学院医药生物技术研究所菌种保藏中心提供。

    1.1.2 细胞株 人骨肉瘤细胞株 MG63 购自中国医学科学院细胞中心；SV40 大 T 抗原转染人成骨细胞 hFOB1.19购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)。

    1.1.3 试剂盒 荧光素酶检测试剂盒购自美国 Promega公司；Real-time PCR 试剂盒购自瑞士 Roche 公司；碱性磷酸酶检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

    1.1.4 主要实验仪器 Agilent 1200 LC 型高效液相色谱仪购自美国 Agilent 公司；AKTAexplorer 快速蛋白液相色谱(FPLC)购自美国 GE Health 公司；Envision 荧光读板仪购自美国 PE 公司；Rotor Gene 3000 型实时定量 PCR仪购自澳大利亚 Corbett Research 公司；Epics XL 型流式细胞仪购自美国 Beckman Coulter 公司；UV-2401 型紫外分光光度计购自日本 Shimadzu 公司；LTQ Orbitrap 型质谱分析仪购自美国 Thermo 公司； VNS 600 型核磁共振分析仪购自美国 Verian 公司 ......