陈小娟，崔佳飞，杨延辉，关艳，张雪莲，肖春玲

    ·论著·

    以结核分枝杆菌H37Rv莽草酸脱氢酶为靶点的高通量筛选模型的建立及应用

    陈小娟，崔佳飞，杨延辉，关艳，张雪莲，肖春玲

    目的建立以结核分枝杆菌莽草酸脱氢酶为靶点的新型抗结核药物高通量筛选模型；用此模型筛选莽草酸脱氢酶抑制剂；进一步评价化合物对莽草酸脱氢酶活性的影响。

    分枝杆菌，结核； 酶抑制剂； 基因表达；莽草酸脱氢酶

    www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2012, 7(3):191-196

    近几年来结核病感染人数逐年攀升，2010 年全球结核病新增 880 万例，中国感染结核的人数已达 1.34 亿，位居世界第二，并且多药耐药结核(MDR-TB)日趋严重，同时结核病与艾滋病共感染现象的不断增加，使结核病疫情的防控面临着更为严峻的挑战[1]。因此开发新型的抗结核药物迫在眉睫。

    莽草酸途径(shikimate pathway)是细菌、真菌、藻类、高等植物等合成三种必需芳香族氨基酸的必需途径[2]，本途径包括七步反应，最终生成分支酸(chorismic acid)。分支酸是合成 L-色氨酸，苯丙氨酸及酪氨酸的前体物质，同时也是合成其他芳香型化合物(诸如叶酸、泛酸和奎宁酸等)的前体物质[3]。莽草酸脱氢酶(shikimate dehydrogenase，SD)是莽草酸合成途径中的关键酶，催化莽草酸途径中的第四步反应，是结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)生长所必需的，SD 利用还原型辅酶 II(NADPH)催化 3-脱氢莽草酸(3-dehydroshikimate，DHS)生成莽草酸(shikimate，SKH)[4]。人体从外界环境中摄取必需芳香族氨基酸，体内不存在莽草酸途径，因此结核分枝杆菌莽草酸脱氢酶(MtSD)是一个很有发展前景的药物作用靶点。

    本研究的目的是建立基于 MtSD 抑制剂的高通量筛选(high throughput screening，HTS)模型，并用此模型筛选莽草酸脱氢酶的抑制剂，进一步评价化合物对莽草酸脱氢酶活性的影响，为发现具有MtSD 抑制作用的先导化合物提供一种快速有效的方法。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1菌株 带有 MtSD 基因的表达工程菌BL21-pET-SD 由复旦大学王洪海实验室提供。耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)mc2155、海分枝杆菌(M. marinum)ATCC BAA-535、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC700603 均购自美国模式培养物集存库(ATCC)；大肠埃希菌(Escherichia coli)、铜绿色假单胞菌(p.aeruginosa)、摩氏摩根(Morganella morganii)耐药菌、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)来自本实验室；甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)R6101、变形杆菌(proteusbacillus vulgaris)为本所武临专老师实验室赠与 ......