罗莉，李坤，王保成，王明蓉

    ·综述·

    包涵体变复性技术研究进展

    罗莉，李坤，王保成，王明蓉

    现代生物技术的迅猛发展使大规模表达异源重组蛋白成为现实，这极大地促进了蛋白类产品的开发，尤其是重组蛋白药物的研发。目前非糖基化的重组蛋白表达多采用大肠杆菌的原核表达系统，该系统的突出特点是表达产物多以包涵体形式存在。与蛋白可溶性表达相比，包涵体具有产量高、蛋白稳定、容易纯化等优点，对毒性蛋白制备尤其适宜。因此，采用包涵体形式已成为规模制备重组蛋白产品的主要途径之一。

    包涵体形成的原因普遍认为主要是外源蛋白在细胞内的高表达使蛋白合成速度过快，没有时间形成正确折叠；另外原核表达系统由于缺乏蛋白翻译后修饰，也容易形成包涵体；培养条件如温度、pH 值、培养基成分等也是影响包涵体形成的因素。由于包涵体绝大多数是不溶的，没有生物活性的，因而需要经过蛋白质变性-复性的过程以恢复其生物活性。目前重组蛋白变复性过程中的技术难点主要在提高蛋白浓度和生物活性两方面，而寻找高效、快速、低成本的变复性方法是该领域研究的重点。随着重组蛋白产品研发的异军突起，包涵体变复性技术的研究再次成为了国内外关注的焦点。

    1 包涵体的变性

    包涵体因具有高密度(1.3 mg/ml)和高抗剪切力，在变性前常采用高压匀浆或超声的方法破碎细菌，然后再洗涤除去破碎后样品中含有的脂类、杂蛋白、核酸、脂多糖等杂质。经过洗涤的包涵体，需要进一步加入变性溶液，以破坏维持包涵体蛋白结构的分子内和分子间作用力，从而使多肽链伸展达到溶解包涵体的作用。

    1.1 变性溶液的改进

    一般常用的变性溶液中含有去垢剂或离液剂。常用的去垢剂如 SDS、十二烷基肌氨酸等，可破坏蛋白内的疏水键，溶解包涵体。常用的离液剂如 6 ～ 8 mol/L 的尿素或盐酸胍，可破坏蛋白间的氢键，使蛋白增溶。强变性剂或变性剂浓度过高可能造成蛋白的不可逆失活，因此采用降低变性剂浓度的温和变性条件，甚至非变性的条件去溶解包涵体成为了该研究的新方向。Tsuji 等[1]报道，在 3.5 mol/L 盐酸胍变性液中加入 8 mmol/L 半胱氨酸可有效溶解包涵体且对其后续的蛋白复性有极大的促进作用。但如果在复性前透析除去半胱氨酸则该变性蛋白复性率又降回到变性液中没有半胱氨酸存在时的复性率。同样，如果将半胱氨酸只加入到复性液中也不能提高复性效率。这为含二硫键蛋白变性条件的优化提供了一个新思路。最近 Li 等[2]比较了 7 mol/L盐酸胍、8 mol/L 尿素、2% Sarkosyl 与 2 mol/L 尿素加高pH 值(通常为 12.5 ......