刘红，刘宾，李瑞娟，杨萌萌，李鹏聪，张鑫，孙旭东，杨铁生

    细胞角蛋白(cytokeratin，CYK)是形成上皮细胞骨架的主要结构蛋白，具有保持上皮细胞完整性的作用[1]。根据等电点和分子量不同，CYK 可以分为 I 型和 II 型，I 型 CYK 属于酸性蛋白，包括 CYK-9 ～ CYK-23，II 型 CYK 属于碱性蛋白，包括 CYK-1 ～ CYK-8[2]。I 型 CYK 中的 CYK-19广泛分布在正常组织表面的层状或鳞状上皮细胞，分子量约为 40 kD[3]。

    CYFRA21-1 是 CYK-19 被半胱天冬酶 3 裂解后，从细胞中释放出来时形成的可溶性片段[4]，在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)、头颈鳞细胞癌、口腔鳞状上皮细胞癌等鳞细胞癌中，或者乳腺癌、肝癌、肺癌和胰腺内分泌肿瘤等转移癌类中都会高表达[5-9]，具有很好的血清诊断学价值，已被作为肿瘤细胞在血液和骨髓中循环的标志物，同时也是预后诊断的重要标志物[10-11]。目前，临床上应用的人血清 CYFRA21-1 免疫检测试剂盒中的抗体主要为进口产品，而具有高结合能力的特异抗体的制备是免疫检测方法成功建立的关键[12]，也是影响检测成本的重要因素。因此，CYFRA21-1特异 mAb 单克隆抗体的制备，对免疫检测方法的建立和检测成本的控制具有重要的意义。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 血清样本 血清样本共计 134 份，其中男性 74 份，女性 60 份，年龄在 20 ～ 92 岁，全部为本院门诊及住院患者样本。

    1.1.2 实验动物 6 周龄，雌性 BALB/c 小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

    1.1.3 主要试剂和仪器 CYFRA21-1 化学发光法定量检测试剂盒为北京源德生物医学工程有限公司产品；CYFRA21-1 重组蛋白购于德国 Progen公司；碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠和辣根过氧物酶标记的山羊抗鼠 IgG 购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；BCIP/NBT 底物显色试剂盒、可溶性单组分 TMB 显色试剂盒购于北京天根生物技术有限公司；蛋白预染和普通 Marker 均购于北京全式金生物技术有限公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺购于 Genview 公司(北京)；0.45 μm PVDF 膜购于北京华美转导科技有限公司；完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、抗 Ig 亚型分析试剂盒(ISO1 型)购自 Sigma 公司；HAT、100 × HT、PEG 4000、RPMI-1640、IMDM 购于美国 Gibco 公司；HItrap Protein G 购自美国 Parmacia Biotech 公司；其他试剂均为国产分析纯；小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)为本实验室保存 ......