惠长野，邵建华，郭妍，张希，杨学琴，王佃鹏

    蝎尾腺分泌的蝎毒具有极大的医学价值，蝎毒的主要活性成分是一类由 28 ～ 76 个氨基酸残基组成的小分子多肽。按其分子的大小，可分为长链和短链两大类。蝎毒素虽然空间结构简单，生理活性却具有多样性，因而一直是研究的热点[1-2]。本实验以东亚钳蝎抗癫痫肽(anti-epilepsy peptide，AEP，GI:37999913)为模型，在实现 rAEP 原核可溶表达的基础上，结合肽链构象预测 His tag 在重组肽不同末端融合时的空间屏蔽效应，并构建相应的表达载体进行验证。为类似活性多肽的重组表达提供借鉴，以满足这类具有药用潜质的多肽的开发需求。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 表达载体及试剂 大肠杆菌 BL21(DE3)为本室保存；非融合表达质粒 pTrx 为沈阳药科大学生化教研室构建[3]；Pyrobest DNA 聚合酶、限制性内切酶 Nco I、EcoR I 及 T4 DNA 连接酶为日本 TaKaRa 公司产品；引物均由上海生工生物工程公司合成；LB 培养基成分购自英国 Oxoid 公司；金属离子螯合柱 HisTrap FF为瑞典 Amersham 公司产品。

    1.1.2 实验动物 昆明种小白鼠(SPF 级)，雄性，体重 20 ～ 25 g，购自沈阳药科大学实验动物中心，合格证号：辽实合字 033 号。实验前，以颗粒状基础饲料饲喂 1 周以适应环境。

    1.2 方法

    1.2.1 AEP 生物信息学分析 Genbank 中搜索AEP 成熟肽同源序列并进行比对分析，根据 PDB库中收录的同源序列空间结构，用 WHAT-IF 软件对 AEP 进行建模。

    1.2.2 pTrx-His-AEP 及 pTrx-AEP-His 表达载体的构建 以东亚钳蝎尾腺 cDNA 库为模板，根据Genbank 中 AEP 成熟肽序列设计引物见表 1。上游引物 P1 中，下划线为 Nco I 酶切位点，6 个组氨酸编码序列加粗显示，下游引物 P2 带有 EcoR I位点及终止密码子，PCR 产物经 Nco I 及 EcoR I双酶切，插入经过同样双酶切的 pTrx 中构建成纯化标签 N端融合的表达载体 pTrx-His-AEP，编码重组肽为 Met-Gly-His6-AEP，重组质粒转录翻译区见图 1。纯化标签 C 端融合的表达载体 pTrx-AEPHis 构建方法同上，下游引物 P4 中引入 6 个组氨酸的编码序列 ......