刘奇，尹磊淼，魏颖，王宇，徐玉东，冉君，杨永清

    蛋白质磷酸化检测方法及原理

    刘奇，尹磊淼，魏颖，王宇，徐玉东，冉君，杨永清

    200030 上海中医药大学上海市针灸经络研究所

    蛋白质是生命活动的物质基础，是机体细胞的重要组成部分。新生蛋白质多肽需要经过翻译后修饰才能转变为成熟蛋白质。翻译后修饰包括：甲基化、羟基化、羧基化、糖基化、脂酰化、异戊烯基化等共价修饰[1]。蛋白质磷酸化是最重要的蛋白质翻译后修饰之一，在蛋白激酶催化作用下，磷酸基团由供体分子转移到蛋白质的含有羟基的氨基酸侧链上，具有可逆性[2]。蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的全部过程，文献显示在任何时间内真核细胞蛋白分子中约有 1/3 的数量在发生磷酸化[3]，主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸上，较少见的磷酸化氨基酸还有精氨酸、组氨酸、赖氨酸以及天冬氨酸和谷氨酸等。蛋白质磷酸化氨基酸有 4 种类型：①氧-磷酸盐，通过羟氨基酸的磷酸化形成；②氮-磷酸盐，通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成；③酰基磷酸盐，通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成；④硫-磷酸盐，通过半胱氨酸磷酸化形成[4]。

    鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对生命活动的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容，用蛋白组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰状态及其变化，其中磷酸化修饰蛋白质的识别与检测是蛋白质组学研究的关键技术之一。

    1 常用蛋白磷酸化检测方法及原理

    1.1 32P 同位素放射性标记法

    蛋白质磷酸化可以通过识别电泳凝胶上的同位素蛋白点来检测。用32P 同位素放射性标记法，即体内代谢培养用32P 同位素放射性标记磷酸盐作为磷酸基团供体，经过磷酸化酶促反应，带有32P 同位素放射性标记的磷酸基团则转移到相应的反应蛋白上，通过凝胶电泳分离，可以用放射自显影或磷储屏检测磷酸化蛋白质。但放射性标记只能在细胞中应用，比较局限且有放射性危险。

    Arrigo 和 Michel[5]采用32P 同位素放射性代谢标记和凝胶电泳分析法，观察了在耐热处理后再经热刺激和肿瘤坏死因子刺激的热休克蛋白 HSP28 磷酸化程度的改变。Aponte 等[6]描述了原位32P 同位素放射性标记完整线粒体基质蛋白的具体方法，并通过二维聚丙烯酰胺凝胶电泳观察了 40 多种蛋白质磷酸化的动态过程，而32P 同位素放射性脉冲追踪进一步揭示了蛋白质磷酸化位点的交替 ......