李慧仙，朱 平

    ·论著·

    同源区段长度对In-Fusion技术连接效率的影响

    李慧仙，朱 平

    目的 在目的基因原载体(DNA 模板)与克隆载体相同的条件下，探讨了 PCR 扩增片段(含目的基因)的末端与载体间同源区段长度对 In-Fusion 连接效率的影响，并建立以In-Fusion 技术为基础的高通量克隆方法。

    定向分子进化； In-Fusion 技术； 同源区段； 高通量克隆

    www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2013, 8(4):241-246

    近年来发展起来的高通量克隆技术广泛应用于定向进化、结构基因组学等研究[1-2]，它不依赖于酶切连接，克服了常规酶切连接法效率低下、载体自连程度高等因素的限制，尤其适用于较大基因片段的高效克隆[3]。根据连接方式的不同，又可分为以下两类：①依赖于 PCR 的连接，例如POE-PCR 技术(prolonged overlap extension PCR)[4]、MEGAWHOP 技术(megaprimer PCR of whole plasmid)[5]等。该类方法均基于 PCR 进行全长质粒扩增，阳性重组率可高达 100%，但是连接成功率取决于两片段能否成功退火，以及在第二轮 PCR中能否有效去除前一轮所用引物，通常技术要求高，不具有应用普遍性；②依赖于同源重组酶的连接，例如 Gateway 技术(Invitrogen)[6]、In-Fusion技术(Clontech)[7]等。Gateway 技术是基于 λ 噬菌体位点特异重组系统，由 BP 和 LR 两个反应构成，两个反应的阳性重组率均可高达 90% 以上，但会引入多余序列。该技术需要特殊含 attR 位点表达载体，Invitrogen 公司提供一系列常用 attR 位点修饰后的表达载体，此外，还可以将目的载体改造成为 Gateway 表达载体。该技术最大的优势在于通过 BP 反应构建入门载体后，通过 LR 反应就可以使插入片段在不同表达载体间快速准确穿梭，便于功能基因的分析和蛋白的表达。In-Fusion技术是依赖于 In-Fusion 酶 3' → 5' 外切酶活性，经短时间即可在插入片段与载体的同源区段(homologous or over-lapping sequence)上形成互补的单链黏端，继而在单链黏端之间自发退火形成重组质粒。In-Fusion 技术适用于任何载体，不需对载体进行改造，也不会引入多余序列，在设计基因片段的上、下游引物时，两引物的 5'-末端分别仅需要 15 个碱基与载体序列相同[8] ......