陈 茜，王志标，唐 微，王 伟，程克棣，孔建强

    虎眼万年青EST文库构建和Syntaxin基因的克隆及生物信息学分析

    陈 茜，王志标，唐 微，王 伟，程克棣，孔建强

    目的 构建虎眼万年青 EST 文库，筛选相关基因并对其进行功能鉴定。

    基因文库； Qa-SNARE 蛋白质类； 虎眼万年青

    www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2013, 8(4):247-253

    虎眼万年青(Ornithogalum saundersiae)是原产于南非的观赏植物，1992 年从中发现了具有显著抗癌活性的甾体类皂苷化合物 OSW-1[1]，它对多种恶性肿瘤细胞都有非常强的抑制作用，是迄今所发现的抗癌活性极强的化合物之一，其 IC50值在0.1 ～ 0.7 nmol/L 之间，高出临床应用的抗癌药物[阿霉素(adriamycin)、顺铂(cisplatin)、喜树碱、丝裂霉素 C 和紫杉醇等] 10 ～ 100 倍，更重要的是它对正常细胞几乎没有抑制作用，具备非常良好的药用前景[1-2]。然而，由于 OSW-1 在虎眼万年青中含量极低，限制了它的进一步应用。因此，寻找一种切实可行的替代方法来提高虎眼万年青皂苷产量对于加快其成药性研究具有非常重要的意义。合成生物学(synthetic biology)的迅猛发展给OSW-1 的规模化制备提供了一个很好的契机[3-5]。

    合成生物学的物质基础是核酸，克隆天然产物生物合成相关功能酶基因以及重要的调控基因并对其进行功能鉴定是进行天然产物合成生物学研究的关键一步。基于此，本论文通过 SMART(switching mechanism at 5'end of mRNA template)法构建了虎眼万年青的全长 cDNA 文库，并利用该文库筛选到了细胞囊泡转运和物质分泌重要调控蛋白之一的 Syntaxin 的编码基因，对其进行了序列分析和初步的表达研究，从而为进一步的功能鉴定奠定了基础。

    1 材料与方法

    1.1 主要材料

    1.1.1 植物材料 虎眼万年青鳞茎自澳大利亚引进，经过诱导后形成愈伤，然后重新诱导出鳞茎。取出无菌鳞茎，放入液氮中速冻，于 -70 ℃ 保存备用。

    1.1.2 菌种和试剂 RNeasy plant mini kit 购自德国 Qiagen 公司；大肠杆菌 Trans1-T1、Transetta (DE3) 以及 T-A 克隆时所用试剂盒 pEASYTMBlunt zero cloning kit 购自北京 Transgen 公司；表达载体 pET-28a(+) 购自德国 Novagen 公司；KOD-Plus 聚合酶购自日本 Toyobo 公司；鼠源His-Tag 单克隆抗体、酶标二抗(山羊抗小鼠 IgG)；IPTG 和卡那霉素购自北京纽朴生物技术有限公司；快速连接试剂盒 In-FusionTMadvantage PCR cloning kit w/cloning enhancer 试剂盒购自美国Clontech 公司；蛋白 marker 购自立陶宛 Fermentas公司 ......