杨月峰，李泽良，鲁茁壮，王华，肖凤君，张群伟，孙慧燕，王立生

    腺病毒载体具有宿主范围广、感染效率高、理化性质稳定、易制备高滴度病毒、不整合入细胞基因组等优点，已被广泛应用于肿瘤基因治疗的基础和临床研究[1-3]。但是，第一代重组腺病毒载体存在包装容量小(约 8 kb)、免疫源性强、目的基因表达持续时间短等缺陷，严重阻碍了其临床应用[4-5]。近年来，在第一代重组腺病毒的基础上，逐渐发展了第二代和第三代重组腺病毒载体。

    第三代重组腺病毒载体，又称辅助病毒依赖性腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vectors，HD-Ad)，去除了所有病毒编码基因，仅保留了 5'和 3' 末端反向重复序列(inverted terminal repeat sequence，ITR)和包装信号(ψ)[6]。因此，HD-Ad载体的包装需要辅助病毒提供病毒复制、包装等功能，而且，HD-Ad 载体的血清型由辅助病毒决定，采用不同血清型辅助病毒，可以实现血清型转换[7]。本实验室前期研究表明，具有 Ad5 和 Ad11p 杂合纤维顶球的重组腺病毒 Ad5/F11p 可显著提高对造血细胞，包括 K562、U937、Jurkat 等细胞系以及 CD34+细胞的感染效率[8]。为实现 HD-Ad 对造血细胞的高效感染，本研究将以 Ad5/F11p 为基础，构建相应的辅助腺病毒，并采用该辅助腺病毒包装携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的第三代腺病毒 HD-Ad5/F11p-GFP；最后，在造血细胞中验证其高效感染能力。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 细胞、质粒和菌种 人胚肾 HEK293 细胞购自美国标准菌种保藏中心(ATCC)，培养于含10% 胎牛血清(FBS)的 DMEM 培养基中；稳定表达 Cre 重组酶的 293 细胞 293Cre4，培养于含10% FBS 和 0.4 mg/ml G418 的 α-MEM 培养基中；人白血病细胞系 K562、U937 和 Jurkat 为本实验室保存，培养于含 10% FBS 的 RPMI 1640培养基中；分离得到的人脐带血 CD34+细胞培养于含 10% FBS 的 IMDM 培养基中。辅助腺病毒H14、重组质粒 pC4HSU-GFP 购自加拿大Microbix 公司；穿梭质粒 pShuttle、大肠杆菌BJ5183 为本实验室保存；重组质粒 pAd5/F11p 为本室构建并保存[8] ......