刘浏，周在威，马晴雯

    链霉菌噬菌体 ΦC31 整合酶可介导链霉菌attB 位点与哺乳动物基因组假 attP 位点之间的重组，从而实现外源基因的位点特异性整合[1]。然而，整合会将载体中的细菌骨架带入基因组，造成安全隐患[2]。微环 DNA 是一种缺乏抗性标记基因和复制原点等细菌序列的小环超螺旋分子，有着较高的生物安全性和转基因表达效率[3]。除传统的阿拉伯糖诱导重组酶表达介导其识别位点重组获得微环DNA 的方法外[4-6]，LR 克隆酶[7-8]也被用于微环DNA 的制备[9]。但该方法同样需要在重组后将微环DNA 回收纯化，操作烦琐，得率也不甚理想。为避免上述问题，本文联合应用 LR 克隆酶和 ΦC31整合酶系统，建立了一种高效、快速获得位点特异整合型微环 DNA 的方法。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 细胞与质粒 人宫颈癌细胞系 HeLa 细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；质粒 pEGFP-N1-attB[10]和 pcDNA3.1(-)-P1A3-TPO[11]由本所构建保存；表达噬菌体 ΦC31 整合酶的质粒 pPGKPhiC31obpA[12]购于美国 Addgene公司(Plasmid No.13795)；大肠杆菌 E.coli TOP10感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司。

    1.1.2 主要试剂 LR 克隆酶、DMEM 培养液、血清及 PBS 均购自美国 Life Technologies 公司，引物及 λattL 和 λattR 也由该公司合成；GenJet?Plus 转染试剂购自美国 SignaGen 公司；限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶购自美国 NEB 公司；SYBR?荧光定量 PCR 试剂购自日本 Takara 公司；hTPO ELISA 试剂盒购自美国 R & D 公司；PCR 纯化试剂盒和胶回收试剂盒购自德国 Qiagen公司。

    1.2 方法

    1.2.1 目的片段的获得 将合成的 λattL 和 λattLrc单链(分别含有限制性内切酶 Afl III 和 Ase I 黏性末端，序列见表 1)干粉配制为 100 μmol/L 的溶液后等物质的量混合，置于 100 ℃ 沸水中待其自然冷却，即得到 λattL 双链。同样方法获得两端分别为 Spe I 和 Dra III 限制性酶切位点黏性末端的 λattR 双链。

    以限制性内切酶 Pvu II 和 Spe I 分别酶切质粒 pPGKPhiC31obpA 和 pcDNA3.1(-)-P1A3-TPO ......