房青，王在，游嘉，詹雪梅，杨爱莲，魏继红，房昭

    卵巢癌是妇科死亡率最高的恶性肿瘤，其发病隐匿，进展迅速，仅有不到 25% 的卵巢癌能在 I期病变局限于卵巢时诊断[1]，大多数患者诊断时肿瘤已经扩散或转移，尽管进行了积极的手术和化疗，卵巢癌患者 5年生存率仍不足 30%[2]。人附睾蛋白 4(human epididymis protein 4，HE4)，又名 WFDC2(WAP type four disulphide core protein 2)，是近年来发现的一个新基因[3]，它在正常卵巢组织中不表达，而在卵巢癌组织高表达[4-5]，在卵巢癌患者血清中浓度显著增高[6]，提示 HE4 可能在卵巢癌的发生发展中起重要作用，HE4 有可能成为卵巢癌辅助诊断和治疗的重要靶标，但是目前对HE4 功能的研究较少。本文利用 RNA 干扰(RNA interference，RNAi)技术，特异性抑制卵巢癌细胞系 SK-OV-3 中 HE4 基因表达，观察 HE4 基因表达下调对卵巢癌细胞增殖和侵袭能力的影响，为卵巢癌侵袭转移的防治提供新的研究线索。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 细胞系 人卵巢浆液性囊腺癌细胞系SK-OV-3 购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。

    1.1.2 siRNA 人 HE4 基因特异性小分子干扰RNA(HE4-siRNA)及非特异性序列 siRNA(阴性对照)购自美国 Santa Cruz 公司。HE4-siRNA 根据基因库 GenBank 中人 HE4 mRNA 序列(NM_006103.3，GI:56699494)设计，为 3 个 20 ～25 nt siRNA 双链的混合物，基因序列见表 1。阴性对照 siRNA(目录号 sc-37007)，为 20～25 nt非特异序列 siRNA。

    表1 人 HE4 基因小分子干扰 RNA(HE4-siRNA)序列Table1 Sequences of small interfering RNA targeted human HE4 (HE4-siRNA)

    1.1.3 试剂 胎牛血清购自美国 Hyclone 公司；McCoy’s 5A 培养基和胰蛋白酶购自美国 Gibco公司；脂质体转染试剂 LipofectamineTM2000 和Opti-MEM 培养基为美国 Invitrogen 公司产品；细胞总 RNA 提取试剂盒 RNeasy Mini Kit 购自美国 Qiagen 公司；反转录试剂盒为美国 ABI 公司产品；SYBR Premix Ex Taq 购自日本 Takara 公司；羊抗人 HE4 蛋白多克隆抗体(sc-27570)、兔抗人 β-actin 多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗羊/兔二抗 IgG 为美国 Santa Cruz 公司产品；增强化学发光试剂 ECL 购自美国 Pierce 公司；细胞计数试剂盒 CCK8 购自日本 Dojindo 公司；人工基底膜基质凝胶 Martrigel 和 Transwell小室(装有碳酸聚酯微孔膜 ......