刘虹，谢琼，李勇枝，薛春美，王静，王佳平

    Tribbles 同源基因 3(tribbles homolog 3，TRB3)是果蝇 tribbles 基因的哺乳动物同源基因，在啮齿类动物中亦被称为神经细胞死亡诱导假激酶(neuronal cell death-inducible putative kinase，NIPK)基因[1]。TRB3 蛋白具有广泛的生物学功能，在多条信号通路中充当了限制性的角色，并且在胚胎发育和癌症、自身免疫性疾病、糖尿病等人类疾病的发生发展中发挥作用[2]。最新的研究表明，TRB3 与纤维化疾病密切相关：纤维化的主要病理改变是组织间胶原的过度沉积，Tang 等[3]发现在心肌细胞中，TRB3 可以差异性调节多种胶原的表达，可以增加 I 型胶原的含量，同时抑制 III 型胶原的表达。在纤维化发生的过程中，成纤维细胞是I 型胶原的主要生产者[4]，而目前并没有关于TRB3 调节成纤维细胞中胶原含量的报道。

    腺病毒载体的外源基因装载量大、表达外源基因效率高，可以感染多种组织或细胞，且容易制得高滴度病毒载体。腺病毒载体进入宿主细胞内并不整合到宿主细胞基因组，安全性高。因而，腺病毒载体是继反转录病毒载体之后，应用范围最广泛且最具前景的病毒载体。因此，本文中使用pAdEasy-1 腺病毒载体，构建了过量表达小鼠TRB3 的腺病毒系统。

    在本研究中，我们使用腺病毒系统在小鼠成纤维细胞中过量表达 TRB3，检测成纤维细胞中 I 型胶原及 III 型胶原的含量，发现 TRB3 的表达可以差异性地调节 I 型胶原与 III 型胶原的含量。这一结果为阐明纤维化疾病的发生发展提供了一定的指导意义，为治疗纤维化疾病提供了新的治疗靶点。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 实验细胞 3T3-NIH 细胞及 HEK293 细胞购于中国医学科学基础医学研究所细胞培养中心。3T3-NIH 细胞使用 DMEM 培养基，10% FBS培养。HEK293 细胞使用 IMDM 培养基，10% FBS培养。每隔 2 天传代一次，细胞培养条件为 37 ℃，5% CO2。

    1.1.2 主要试剂 DMEM、IMDM 细胞培养基、进口血清 FBS 和胰酶购于美国 Gibco 公司；pEASY- T1 simple 载体、TransScript 反转录酶和高保真 DNA 合成酶购于北京全式金生物技术有限公司；T4 DNA 连接酶、Pme I、Pac I 限制性内切酶购于美国 NEB 公司；Trizol、Lipofectine 2000 转染试剂购于美国 Invitrogen 公司；pADEasy-1 腺病毒表达系统购于德国 Merck 公司；小量腺病毒纯化提取试剂盒购于德国 Biomega 公司；天狼猩红染色试剂盒购于英国 Biocolor 公司；抗小鼠TRB3 购于美国 Sigma-Aldrich 公司 ......