蔡晓娜，王鹏，贺晓强，刘立平，陈海容，郭晋霞，范开

    重组白细胞抑制因子-水蛭肽嵌合蛋白(recombinant neutrphil inhibitory factor and hirulog hybrid，TNHH)是一种通过基因工程技术改造的新型嵌合蛋白，临床上可用于急性脑栓塞后的脑组织损伤修复，减少脑水肿，防止微小血栓形成从而改善微循环，是一种有前景的心脑血管疾病治疗创新药物，目前已进入临床 I、II 期研究[1-2]。由于在生产过程中使用了工程菌大肠杆菌，而宿主菌的残留 DNA 是重组药物中特有的潜在致癌性杂质，可能会随药物一同进入人体最终致癌，因此对 TNHH 原液中外源性 DNA 残留量的检测极为重要[3]。

    目前对重组生物制品的残留宿主 DNA 检测方法有多种[4-6]，与其他方法相比，地高辛标记探针杂交法具有灵敏度高、特异性强、对操作人员无放射危害等优点[7]。本文采用分子杂交法，从小片段基因组 DNA 的制备、纯化、处理、阳性样品的制备等方面进行优化，建立了 TNHH 制备过程中工程菌 DNA 残留的质控方法。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    TNHH 工程菌、TNHH 原液由重庆富进生物医药有限公司制备；地高辛标记和检测试剂盒购自美国罗氏公司；正电荷尼龙膜购自美国安玛西亚公司；细菌基因组 DNA 提取试剂盒购自美国 Invitrogen 公司。

    1.2 方法

    1.2.1 工程菌基因组 DNA 的制备 按照基因组 DNA提取试剂盒说明制备 TNHH 工程菌基因组 DNA，并通过1% 琼脂糖凝胶电泳和微量核酸蛋白测定仪测定 DNA 纯度和浓度，并于 –20 ℃ 冻存备用。

    1.2.2 模板 DNA 的制备 超声处理基因组 DNA，恒定功率，不同超声次数得到大小不同的 DNA 样品，电泳检测 DNA 片段大小。

    1.2.3 探针的制备 取 1 μg 超声处理过的基因组 DNA，加入无菌水至终体积 16 μl，沸水浴 10 min 后，立即冰浴10 min 迅速冷却。取 4 μl 地高辛高效标记引物加入变性DNA 中，混匀后 500×g 离心 20 s。37 ℃ 孵育过夜，加入 2 μl 0.2 mol/L EDTA(pH 8.0)终止反应，置于 –20 ℃ 保存。另一组 EDTA 终止后，加 5 μl 4 mol/L 氯化锂、75 μl 冰乙醇 ......