孙彩霞，张振亮，郑海洲，路新华，郑智慧，赵宝华，段宝玲

    糖皮质激素受体α调节剂高通量筛选模型的建立及应用

    孙彩霞，张振亮，郑海洲，路新华，郑智慧，赵宝华，段宝玲

    050016 石家庄，河北师范大学生命科学学院(孙彩霞、张振亮、郑智慧、赵宝华)；050013 石家庄，华北制药集团新药开发有限责任公司(郑海洲、路新华、郑智慧、段宝玲)

    建立不同分子作用机制的糖皮质激素受体α(GRα)调节剂高通量筛选模型，筛选新型糖皮质激素受体调节剂。

    克隆 GRα 的配体结合域 LBD 和全长基因，构建哺乳动物细胞表达载体pBIND-GAL4-GRα LBD、pTARGET- GRα，分别与已构建的含 GAL4 响应元件 5 × UAS 的荧光素酶报告质粒 p5 × UAS-luc 和含有 4 × GRE 的报告质粒 pGRE-luc 共转染 HeLa 细胞，建立两种不同机制的报告基因细胞筛选方法，通过报告基因的表达检测化合物对 GRα 受体转录调控功能的调节剂作用；利用实时定量 PCR 方法进一步验证化合物对糖皮质激素受体靶基因 mRNA 水平的调控作用。

    经过分别共转染表达质粒和报告质粒，GRα 激动剂地塞米松可剂量依赖地诱导 5 × UAS-luc 和 4 × GRE-luc 两个模型的荧光素酶的表达，在 5 × UAS-luc 模型中，最大上调倍数可达(9.0 ± 0.2)倍，EC50值为(0.28 ± 0.07)mmol/L，Z' 因子为 0.52。在 4 × GRE-luc 模型中，最大上调倍数可达(3.2 ± 0.3)倍，EC50值为(1.81 ± 0.13)mmol/L，Z' 因子为 0.49。利用模型 pBIND-GAL4-GRα LBD/p5 × UAS-luc 从 2000 多个微生物和植物来源的天然以及合成化合物中筛选得到 1 个微生物来源的天然产物黑麦酮酸D，黑麦酮酸D 对 GRα 具有 2 ~ 3 倍的激动活性。进一步的定量 PCR 的结果说明黑麦酮酸D 能有效上调多个 GRα 调控的靶基因的表达。

    两种报告基因筛选方法灵敏、稳定，可以用于 GRα 调节剂的高通量筛选。

    糖皮质激素受体 α； 生物应答调节剂； 降血糖药； 高通量筛选

    糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor，GR)是核受体家族中的重要成员，是一种可溶性单链多肽组成的磷蛋白[1]，也是一种典型的激素依赖性转录调节因子[2]，与激素结合后通过和靶基因中糖皮质激素反应元件(glucocorticoid receptor response element ......