周爽，蒙建洲，关艳，胡辛欣，司书毅，肖春玲

    以丙氨酸消旋酶为靶点的高通量抗结核药物筛选模型的建立及应用

    周爽，蒙建洲，关艳，胡辛欣，司书毅，肖春玲

    100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所国家新药(微生物)筛选实验室

    建立以结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶为靶点的新型高通量抗结核药物筛选模型，筛选丙氨酸消旋酶的抑制剂，获得以丙氨酸消旋酶为靶点的新型抗结核药物先导物。

    以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组为模板，pET28a表达质粒为载体，将基因克隆至 pET28a，构建 pET28a::重组表达质粒，表达并纯化得到重组结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶；通过测定反应产物 NADH 在 340 nm 处光密度变化速率，检测酶反应活性，构建并优化该酶抑制剂的高通量筛选模型；应用该模型对化合物库进行筛选；测定活性化合物 IC50以及对结核分枝杆菌的 MIC。

    成功构建了结核分枝杆菌基因的表达载体；得到了纯度较高的重组丙氨酸消旋酶，测得该酶的比活力为 13.53 kU/mg；所建立的丙氨酸消旋酶高通量筛选模型稳定性高，符合高通量筛选的要求；通过对 70 000 个化合物进行筛选，得到了 5 个活性较高的化合物，其中，IMB-XZ5 对结核分枝杆菌的 MIC 为 4 ~ 8 μg/ml，且对结核分枝杆菌的作用具有较高的特异性。

    建立了稳定性好、灵敏度较高的结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶抑制剂高通量筛选模型，应用该模型筛选得到了具有较好抗结核活性的丙氨酸消旋酶抑制剂。

    丙氨酸消旋酶； 抗结核药； 酶抑制剂； 高通量筛选

    近年来结核病感染人数逐年攀升，2012 年全球结核病新增 860 万人，结核病死亡人数约 130 万人[1]。中国是结核病高负担国家，多药耐药结核病以及与 HIV 结合感染情况的增加，使结核病疫情的防控面临着更为严峻的挑战。快速研发新型抗结核药物，解决结核病治疗所面临的难题成为控制结核病疫情的当务之急。

    针对已经确认的靶点寻找全新结构抗结核新药是最快捷而有效的途径。丙氨酸消旋酶(alanine racemase，ALR)是已经确认的抗结核药物靶点，该酶可以催化 L-丙氨酸与 D-丙氨酸之间相互转化[2-3]。D-丙氨酸是菌体细胞壁中肽聚糖合成的必需前体物质，而自然界中只存在天然来源的 L-丙氨酸，因此 L-丙氨酸进入菌体后必须通过 ALR 的催化作用生成 D-丙氨酸，用于细胞壁的合成[4]。ALR 广泛存在于原核细胞中，且在不同的生物体中的相似性较高 ......