刘亚晋，谭初兵，时丽丽，潘晓菲，徐为人

    人CaMKKβ蛋白的原核表达、纯化及活性测定

    刘亚晋，谭初兵，时丽丽，潘晓菲，徐为人

    300070 天津医科大学基础医学院(刘亚晋、潘晓菲)；300193 天津药物研究院天津新药设计与发现重点实验室(谭初兵、时丽丽、徐为人)

    对原核体系表达的 CaMKKβ 蛋白体外活性进行探索，为针对 CaMKKβ、AMPK 药物研发提供科研基础。

    克隆人 CaMKKβ 基因，建立原核表达载体 pET28a-CaMKKβ，将其转化入Rosetta(DE3) 感受态细胞内，在 16 ℃、0.02 mmol/L IPTG 条件下诱导重组表达 CaMKKβ 蛋白，Ni-NTA 纯化6His-CaMKKβ 蛋白，并利用 Glo? Max Assay 方法检测其活性。

    通过基因测序表明 pET28a-CaMKKβ 质粒构建成功；重组人 CaMKKβ 蛋白可溶性表达量较高，Ni-NTA 纯化 6His-CaMKKβ 蛋白纯度可达 80% 以上，活性检测结果表明，大肠杆菌体系内表达的人 CaMKKβ 蛋白在 CaM/Ca2+存在与否情况下，酶活基本一致。

    成功构建原核表达载体 pET28a-CaMKKβ，实现重组人 CaMKKβ 在原核体系内可溶性表达，活性测定表明原核体系内表达的 CaMKKβ 自主酶活性较强，受 CaM/Ca2+影响较小。

    钙-钙调素依赖性蛋白激酶； 腺苷酸活化蛋白激酶； 色谱法，亲和； CaM/Ca2+

    钙调蛋白(calmodulin，CaM)作为一种广泛存在的第二信使，受 Ca2+浓度的调节，参与细胞内众多信号通路的调控：cAMP 合成与分解的腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶酶活调控、CaMKs/CaM(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase，CaMKs)信号级联的调控等[1-2]。CaMKs 还包括 CaMKI、CaMKII、CaMKIV等[3]，CaMKK(Ca2+/calmodulin- dependent protein kinase kinase，CaMKKs)是 CaMKs 家族中的主要成员，有CaMKKα 和CaMKKβ 两种亚型，可通过磷酸化激活 CaMKI、CaMKIV、PKB、SAD-B 等[4-6]。CaMKKα 活性仅受 CaM/Ca2+信号的调控，而 CaMKKβ 除受 CaM/Ca2+信号调控外，还具有自主活性，后者可通过磷酸化 Thr/Ser 位点激活下游底物腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)等[7-8] ......