吕卫东，李俊鑫，刘绿艳，李欣，崔璐璐，万晓春

    人OX40胞外区基因的克隆、原核表达及单克隆抗体的制备

    吕卫东，李俊鑫，刘绿艳，李欣，崔璐璐，万晓春

    518055 深圳，中国科学院深圳先进技术研究院(吕卫东、李俊鑫、刘绿艳、万晓春)；121000 锦州，辽宁医学院基础医学院(李欣、崔璐璐)

    制备抗人OX40 单克隆抗体，为进一步研究OX40/OX40L 通路以及针对该通路进行疾病干预、疾病治疗和药物筛选奠定基础。

    PCR扩增人OX40 胞外区的基因序列，将其构建到原核表达载体pET-32a(+) 中，利用大肠杆菌表达系统表达OX40 胞外区蛋白，经Ni 柱纯化后获得目的蛋白。以纯化的OX40 胞外区蛋白为免疫原免疫小鼠，采用常规方法进行细胞融合，通过ELISA和多次克隆化培养，筛选出分泌特异性鼠抗人OX40 单克隆抗体的杂交瘤细胞株；通过ELISA、Western blot 和免疫荧光检测抗体的效价及特异性。

    成功构建人OX40 原核表达质粒pET-32a(+)-OX40，并在BL21(DE3) 中诱导表达，经SDS-PAGE 和Western blot 鉴定、Ni 柱纯化、透析后获得OX40 胞外区蛋白；以此纯化蛋白为免疫原，成功制备具有较强亲和力的单克隆抗体。

    克隆表达并纯化了人OX40 蛋白，成功制备针对该蛋白的高亲和力单克隆抗体，为进一步研究OX40/OX40L 的生物学功能奠定了实验基础。

    受体，OX40； 基因表达； 抗体，单克隆

    OX40(CD134)属于 TNFR 超家族成员之一，为 I 型跨膜糖蛋白，主要表达在活化的 CD4+和 CD8+T 细胞表面，其配体 OX40L 在活化的 B 细胞、树突细胞和内皮细胞上均有表达[1-2]。在机体的免疫应答过程中，OX40/OX40L 作为一对重要的共刺激分子，为 T、B 细胞的激活提供了重要的共刺激信号，其信号传导也与效应细胞存在和功能相关[3-4]。由于 OX40/OX40L 在机体的免疫应答和自身免疫性疾病的发生发展中发挥了重要作用，并随着生物学功能的进一步揭示逐渐成为临床干预自身免疫性疾病、移植排斥反应和肿瘤的一个理想靶点[5]。

    1 材料与方法

    1.1 主要材料

    pET32a(+)、pLVX-IRES-ZsGreen、BL21(DE3)、HEK293T 细胞由本实验室保存；人 OX40 基因全长 ORF 克隆购自北京义翘神舟生物技术有限公司；DMEM 培养基、胎牛血清、HAT 及 PEG4000 购自美国 Sigma 公司；限制性核酸内切酶、Taq DNA 聚合酶、DNA 分子量标记均购自日本 Takara 公司；T4 DNA 连接酶为美国 Thermo 公司产品；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购于北京康润诚业生物科技有限公司 ......