张岗，胡本祥，李依民，张大为，郭顺星

    铁皮石斛谷氨酸脱羧酶基因的分离与生物信息学分析

    张岗，胡本祥，李依民，张大为，郭顺星

    712046 西安，陕西中医学院药学院/陕西省中药基础与新药研究重点实验室(张岗、胡本祥、李依民)；100193 北京，中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所(张岗、张大为、郭顺星)

    分离珍稀濒危兰科药用铁皮石斛谷氨酸脱羧酶(GAD)基因并进行生物信息学和表达分析。

    采用 RT-PCR 和 RACE 技术获基因 cDNA 全长；利用生物信息学软件分析蛋白理化性质、结构域和三维建模等分子特性；用 DNASTAR 6.0 和 MEGA 4.0 分别进行氨基酸多序列比对和进化树分析；借助实时定量 PCR 检测基因表达。

    分离到基因，cDNA 全长 1795 bp，编码一条由 498 个氨基酸组成的多肽，分子量55.90 kD，等电点 5.32；DoGAD 蛋白不含跨膜域或信号肽，具有谷氨酸脱羧酶和磷酸吡哆醛依赖的脱羧酶结构域(17-443、37-381)；DoGAD 与植物 GADs 蛋白一致性为 69.5% ~ 78.8%，隶属于 GADs 分子进化树的植物类群；转录本在石斛叶和茎中相对表达量较高，分别为根中的 5.16 和 3.92 倍。

    成功克隆得到铁皮石斛谷氨酸脱羧酶基因全长，的表达特征暗示其可能在铁皮石斛叶和茎中发挥重要的调控作用。

    铁皮石斛； 谷氨酸脱羧酶； γ-氨基丁酸； 计算生物学； 基因克隆

    谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)是生物体中普遍存在的一类胞内酶，主要分布于细胞质中，以磷酸吡哆醛为辅因子催化谷氨酸转化为一种四碳非蛋白质氨基酸，即 γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid，GABA)[1]。GABA 被证实是哺乳动物中枢系统中一种重要的抑制性神经递质，具有降血压、调节内分泌、健脑安神等多种生理功效；GABA 在植物细胞逆境防御、氮素储存、激素合成以及生长发育等过程中起重要作用[1]。在食品科学领域，GABA 正在作为新资源食品获得广泛关注[2]。

    基因现已从矮牵牛[3]、拟南芥[4]、水稻[5]、烟草[6]、香蕉[7]和人参[8]等多种植物中获得克隆和鉴定。植物 GAD 蛋白 C 末端普遍含有一个钙调蛋白(calmodulin，CaM)结合域，能够与 CaM 结合增加酶活。植物受低温、高温、高盐或伤害等外源环境因子刺激时，胞内产生 Ca2+峰，进而结合 CaM 活化 GAD 蛋白 ......