王玉梅，徐超，刘艳，高尚先

    人谷草转氨酶的基因改造及高效重组表达

    王玉梅，徐超，刘艳，高尚先

    100050 北京，中国食品药品检定研究院体外诊断试剂室/卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室

    构建人谷草转氨酶(AST)高效重组表达体系。

    优化编码人 AST 的核苷酸密码子，合成人 AST 新的基因，并将其克隆至 pRSF-Duet 表达载体中，转化大肠杆菌 BL21，以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白的表达，并通过改变诱导剂浓度、振摇速度及诱导温度优化表达条件，以产生可溶性蛋白。可溶性蛋白经镍离子柱亲和层析及分子筛层析纯化，以SDS-PAGE 电泳及蛋白质免疫鉴定蛋白的性质，对重组蛋白的活性及在血清基质中的稳定性进行检测。

    经过优化的 AST 密码子在大肠杆菌中的使用频率均在 10% 以上；重组蛋白存在于上清和沉淀中，经表达优化，在 IPTG 终浓度为 2 mmol/L、25 ℃、150 r/min 振摇8 h 诱导条件下，可增加可溶性蛋白的产率，纯化后的目的蛋白经电泳及免疫印迹鉴定为谷草转氨酶，活性可达136 000 U/L，且在含有蛋白酶抑制剂的血清中稳定存在。

    通过密码子优化，成功构建了重组 AST 的高效表达系统，重组蛋白可以达到作为参考物质原料的要求。

    谷草转氨酶； 重组表达； 基因改造； 密码子； 参考物质

    人谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)广泛分布于人体各组织中，其与谷丙转氨酶是临床酶学测定项目中测定量最大、应用最广泛的两种重要血清酶[1]。AST 不仅存在于肝脏，也存在于心脏、骨骼肌、肾脏等组织，因此，可用于辅助诊断心肌梗死、骨骼肌疾病、急性肾炎、代谢性疾病等[2-3]；近年来，AST 对于冠脉搭桥等植入体的疗效评价的意义也逐渐受到重视[4-5]，AST 测定值的准确性直接影响到对疾病的诊断，因而质控与评价 AST 测定试剂的质控品、校准品、标准品等参考物质变得尤为重要。我国目前转氨酶相关的参考物质主要是筛选不同转氨酶活性的人血清来制备，一方面存在安全隐患，另一方面受到原料来源的限制。本研究探索一种高效重组表达体系，为 AST 相关参考物质的生产提供高质量的原料来源。

    1 材料与方法

    1.1 主要材料

    质粒表达载体 pRSF-Duet、大肠杆菌菌株 BL21为本科室保存；限制性内切酶H I、RI和质粒提取试剂盒购自工程()；Halt 蛋白酶抑制剂混合物购自美国赛默飞世尔科技公司；谷草转氨酶测定试剂盒购自北京利德曼生化股份公司；镍亲和层析柱购自上海生工生物工程股份有限公司；兔抗人 AST 抗体、HRP 标记的羊抗兔IgG 抗体为美国 Sigma 公司产品；电泳仪、转膜仪、NGC 色谱层析系统为美国Bio-Rad 公司产品；ABI 9700 PCR 仪为美国ABI 公司产品；柯达凝胶成像系统 4000R 为美国Carestream 公司产品；全自动生化分析仪为日本 HITACHI 日立公司产品 ......